Diagnostik hämatologischer Erkrankungen

A. Hämatologisches Speziallabor und Knochenmarklabor
B. Durchflusszytometrie (FACS-Labor)
C. Wissenschaftliche Projekte

A. Hämatologisches Speziallabor und Knochenmarklabor

Beurteilung der Zusammensetzung der Zellen im peripheren Blut

Im peripheren Blut finden sich beim gesunden Menschen normalerweise nur die ausgereiften hämatopoetischen Zellen: kernlose Thrombozyten und Erythrozyten sowie kernhaltige, reife Formen der Granulopoese, Monozytopoese und reife Lymphozyten. Die Beurteilung eines Ausstrichs von peripherem Blut erlaubt anhand der Morphologie der peripheren Blutzellen Rückschlüsse auf Anämieursachen und auf Erkrankungen der Thrombozyten oder der weißen Blutzellen  z. B. bei Verdacht auf lymphoproliferativen oder myeloproliferativen Erkrankungen. Besonders charakteristische Veränderungen finden sich im peripheren Blut unter anderem bei der chronischen lymphatischen Leukämie (CLL) und der chronischen myeloischen Leukämie (CML). Nicht selten werden bei akuten Leukämien Blasten ins periphere Blut ausgeschwemmt und ermöglichen somit die Diagnose der Krankheit.

Knochenmarkpunktion

Im normalen Knochenmark finden sich vorwiegend kernhaltige Zellen, von denen etwa zwei Drittel den Vorstufen der weißen Blutkörperchen und ein Drittel den Vorstufen der roten Blutzellen zugeordnet werden können. Daneben kommen thrombozytäre Vorstufen, Stromazellen und gelegentlich auch einige seltenere Zellarten vor. Je nach Punktionstechnik findet sich im Ausstrich neben den Knochenmarkzellen in unterschiedlichem Maße auch beigemischtes peripheres Blut.

Knochenmarksausstriche erlauben Rückschlüsse auf die Zusammensetzung der Zellen und die Zelldichte im Knochenmark. Anhand morphologischer Merkmale werden die Zellen des blutbildenden Systems den einzelnen Reifungsstadien der verschiedenen Zellreihen eingeteilt. Beurteilt wird zum einen die Ausreifung der Zellen einer bestimmten Reihe (normale Ausreifung versus Ausreifungsstörung mit Linksverschiebung,  Rechtsverschiebung oder Dysplasie), zum anderen das quantitative Verhältnis der einzelnen Zellreihen zueinander. Mittels Knochenmarkzytologie können akute Leukämien, myelodysplastischen Syndrome und  myeloproliferative Erkrankungen diagnostiziert werden. Bei Lymphomen können aus der Beurteilung der Knochenmarkzytologie Rückschlüsse auf Knochenmarkinfiltration durch das Lymphom gezogen werden. Die Knochenmarkzytologie dient als ein wichtiger diagnostischer Bestandteil in der Abklärung von Anämien, unklaren Thrombozytopenien, unklaren Leukopenien und unklarer Panzytopenie.

Liste der Indikationen für die Knochenmarkspunktion

1. akute Leukämie (AML, ALL): Erstdiagnose, Therapiekontrolle, Verdacht auf Rezidiv
2. chronische Leukämien (CML, CLL): Erstdiagnose, Therapiekontrolle, Verdacht auf Rezidiv, Verdacht auf blastische Transformation (CML)
3. myelodysplastische Syndrome (MDS): Erstdiagnose, Verdacht auf akute Transformation / Übergang in eine AML
4. myeloproliferative Syndrome (MPS): Erstdiagnose, Übergang in eine akute Leukämie
5. Non-Hodgkin-Lymphome (NHL): Erstdiagnose, Verdacht auf Rezidiv (außer M. Hodgkin)
6. Multiples Myelom (MM): Erstdiagnose, Therapiekontrolle, Verdacht auf Rezidiv
7. Monoklonale Gammopathie: Erstdiagnose, Verdacht auf Progress
8. Abklärung systemischer Amyloidosen
9. Verdacht auf Knochenmarkkarzinose bei soliden Tumoren
10. Anämieabklärung: z. B. Verdacht auf megaloblastäre Anämie bei Vitamin-B12-Mangel, Verdacht auf  toxische Schädigung der Hämatopoese
11. Thrombozytopenieabklärung: z. B. bei Immunthrombozytopenie
12. sonstige Leukozytose- oder Leukopenieabklärung
13. Infektionskrankheiten und Parasitosen: z. B. Verdacht auf Leishmaniose

Beurteilung eines peripheren Blutausstrichs:

Diagnostik von Leukämien anhand der Knochenmarkzytologie

Probeneinsendungen

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Kontakt

Knochenmark-Labor
Medizinische Klinik – Innere Medizin V 
Im Neuenheimer Feld 410   
69120 Heidelberg    
Tel.: +49 (0) 6221 -  56 38808
Fax: +49 (0) 6221 - 56 2857
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Mitarbeiter

• Dr. med. Jolanta Dengler, Fachärztin für Innere Medizin, Hämatologie, Internistische Onkologie; Leiterin des Hämatologischen Diagnostiklabors
• Gudrun Mayer, Medizinisch-Technische Assistentin
• Heike Arnold, Medizinisch-Technische Assistentin
• Sandra Kräker, Medizinisch-Technische Assistentin

Fortbildung in der Medizinischen Klink V

Diagnostik-Fortbildung im Rahmen der Leukämie-Konferenz donnerstags von 12.30 bis 13.00 Uhr.

B. Durchflusszytometrie (FACS-Labor)

Prinzip der Durchflusszytometrie:

Bei ausgewählten hämatologischen Fragestellungen steht die Immunphänotypisierung mittels Durchflusszytometrie (FACS-Analyse) von peripherem Blut, Knochenmark oder anderen Körperflüssigkeiten wie broncho-alveoläre Lavage (BAL), Liquor cerebrospinalis oder Pleuraerguss zur Verfügung. Bei der Durchflusszytometrie werden zelluläre Eigenschaften während der Bewegung in einem Flüssigkeitsstrom gemessen. Zellen fließen in einem Flüssigkeitsstrom als Einzelpartikel durch einen Laserlichtstrahl hindurch. Unmittelbar nachdem die einzelnen Zellen in Kontakt mit dem Laserstrahl kommen, senden sie Lichtteilchen (Photonen) aus und streuen so das Licht. Dieses fällt auf spezifische Detektoren, die elektrische Impulse abgeben. Anschließend werden diese Daten digitalisiert. Das Resultat kann z. B. als so genannter Dot Plot dargestellt werden, in dem jede einzelne Zelle der Probe als Punkt in einem Koordinatensystem wiedergegeben wird. 
Untersucht werden dabei folgend Zelleigenschaften:

• Vorwärtsstreulicht (FSC): Parameter, der gemessen wird, wenn das Licht entlang der Achse des Laserstrahls gestreut wird. Die Vorwärtsstreuung ist ungefähr proportional zur Zellgröße. 
• Zellgranularität (SSC): Parameter, der gemessen wird, wenn das Licht rechtwinkelig zum Laserstrahl gestreut wird. Dieser Parameter korreliert mit dem Gehalt der Zellgranula in der Zellen (Zellgranularität).
  So lassen sich Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten anhand ihres FSC- und SSC-Wertes voneinander unterscheiden. 
• Zusammensetzung der Oberflächenproteine (Antigene): nach vorheriger Behandlung mit Antikörpern, die an Fluorochrome gebunden sind, werden Oberflächenantigene erkannt. Dies erlaubt eine genauere Zuordnung der Zellen z. B. im Fall von Lymphozyten zu B-Lymphozyten oder T-Lymphozyten und im Fall von leukämischen Blasten zu Lymphoblasten oder myeloischen Blasten. Durch diese spezifische Zuordnung wird unter anderem die immunzytologische Charakterisierung von Leukämien und Lymphomen möglich.

Liste der Indikationen für die Durchflusszytometrie und Vorschläge zur Materialeinsendung  für die FACS-Analyse:

Diagnose von akuten Leukämien:

1. Akute Leukämie Erstdiagnose: 10 ml Heparin peripheres Blut (PB) oder Knochenmark (KM)
2. Myelodysplastisches Syndrom (MDS) bei Erstdiagnose: 10 ml Heparin KM, kein PB
3. Myelodysplastisches Syndrom (MDS) im Verlauf (innerhalb wissenschaftlicher Fragestellungen): 10 ml Heparin KM, kein PB
4. AML im Verlauf: Remissionsbeurteilung nach Induktion, Verdacht auf Rezidiv: 10 ml Heparin KM
5. ALL im Verlauf: Remissionsbeurteilung nach Induktion, Verdacht auf Rezidiv: 10 ml Heparin KM

Minimale Resterkrankung ( MRD) - Analyse bei akuten Leukämien:

1. AML-MRD nach allogener Transplantation: 2 x 10 ml Heparin KM
2. ALL-MRD nachallogener Transplantation: 2 x 10 ml Heparin KM
3. Diagnose von Lymphomen:
4. B-NHL: Erstdiagnose, Verdacht auf Rezidiv: 10 ml Heparin PB oder KM
5. T-NHL: Erstdiagnose, Verdacht auf Rezidiv: 10 ml Heparin PB oder KM
6. T-Zell-Rezeptor-Analyse (TCR) bei Verdacht auf eine klonale T-Zell Erkrankung: 10 ml Heparin PB 

Minimale Resterkrankung ( MRD) - Anaylse bei NHL:

1. B-NHL-MRD nach allogener Transplantation: 20 ml Heparin PB oder 2 x 10 ml Heparin KM
2. T-NHL-MRD nach allogener Transplantation: 20 ml Heparin PB oder 2 x 10 ml Heparin KM

Immunsystem:

1. CD4:CD8 und Immunstatus 100 nach allogener Stammzelltransplantation:  10 ml Heparin PB oder 10 ml EDTA PB
2. Verdacht auf Immundefekt bei B-Symptomen, rezidivierenden Infekten, unklarem Fieber: 10 ml Heparin PB oder 10 ml EDTA PB

Körperflüssigkeiten:

1. BAL (broncho-alveoläre Lavage) oder Ergüsse bei speziellen Fragestellung wie Beteiligung bei NHL, Sarkoidose, BOOP: 10 ml native Flüssigkeit
2. CSF (Liquor cerebrospinalis) bei speziellen Fragestellungen wie AML, ALL, NHL, MM: 5 ml native Flüssigkeit

Myeloproliferative Erkrankungen:

1. Mastozytose zur Erstdiagnose: 10-20 ml Heparin KM
2. CD34 Zellzahl im PB bei CML und bei myeloproliferativen Erkrankungen: 10 ml EDTA (!) PB

Keine Indikation: 

1. Morbus Hodgkin
2. Morbus Werlhof
3. CML, wenn kein Verdacht auf Transformation
4. MPS, wenn kein Verdacht auf Transformation (aber Bestimmung der Zahl an CD34 Zellen sinnvoll!)
5. Multiples Myelom (MM), außer bei speziellen Fragestellungen (CD20 Bestimmung, Verdacht auf hochmaligne Transformation, Verdacht auf ZNS-Beteiligung)

Diagnostik von Leukämien und Lymphomen

Probeneinsendung

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Kontakt

FACS-Labor  
Medizinische Klinik – Innere Medizin V  
Im Neuenheimer Feld 410   
69120 Heidelberg    
Tel.: +49 (0) 6221 - 568064  
Fax: +49 (0) 6221 - 568588
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Mitarbeiter

• Dr. med. Jolanta Dengler, Fachärztin für Innere Medizin, Hämatologie, Internistische Onkologie, Leiterin des Hämatologischen Diagnostiklabors
• Dr. med. Julian Topaly, Assistenzarzt
  Eddy Basuki, Medizinisch-technischer Assistent

Fortbildung in der Medizinischen Klink V

Diagnostik-Fortbildung im Rahmen der Leukämie-Konferenz donnerstags von 12.30 bis 13.00 Uhr.

C. Wissenschaftliche Projekte

• Verbesserung der hämatologischen Diagnostik von Leukämien und Lymphomen durch Evaluation neuer Marker für die Durchflusszytometrie
• Analyse der minimalen Resterkrankung bei akuten Leukämien, niedrig malignen Lymphomen und der chronischen lymphatischen Leukämie nach allogener Stammzelltransplantation
• Nachweis endothelialer Vorläuferzellen (EPC) im peripheren Blut bei Patienten mit myeloproliferativen Stammzellerkrankungen
• Immunzytologische Diagnostik nach allogener Stammzelltransplantation

Ausgewählte Publikationen

• Frühauf S, Topaly J, Wilmes A, Ho A.D.
  Durchflusszytometrische Diagnostik maligner hämatologischer Erkrankungen.
  In: Zeller WJ, zur Hausen H (Eds.). Onkologie, Ecomed Verlag, Landsberg/Lech, 10. Ergänzungslieferung, Kapitel II.4, Seite 1-32.
• Perz J, Topaly J, Fruehauf S, Hensel M, Ho AD.
  Level of CD20-expression and efficacy of rituximab treatment in patients with resistant or relapsing B-cell prolymphocytic leukemia and B-cell chronic lymphocytic leukemia.
  Leuk Lymphoma 2002; 43(1): 149-151.
• Frühauf S, Perz J.
  Immunfluoreszenz-Durchflusszytometrie bei Non-Hodgkin Lymphomen
  Laborpraxis 2004; 5: 18-20.

Stipendien

Dr. med. Jolanta Dengler erhielt im  Oktober 2006 das Forschungsstipendium der Roche Pharma AG. Das Stipendium dient dem zweimonatigen Forschungsaufenthalt im Labor von Professor Alberto Orfao (Universidad de Salamanca, Servicio General de Citometria) in Spanien zur Durchführung des Projekts „Minimale Resterkrankung bei Leukämien und Lymphomen nach allogener Stammzelltransplantation“.