Immunologie

Arbeitsgruppe Molekulare Immundiagnostik

 

 

Dr. Thomas Giese

 

Die Plastizität und Komplexität des Immunsystems sind diagnostisch nur schwer erfassbar. So genannte „Normbereiche“ haben nur bedingt Aussagekraft für den individuellen Patienten. Krankheitsaktivitäten wie zum Beispiel bei chronischen Entzündungen lassen sich nur schwer objektivieren. Dies hat zur Folge, dass die Behandlung der Patienten oft nur nach empirischen Kriterien erfolgt und dass es kaum Surrogat-Marker gibt, welche der Therapieoptimierung dienen. Biomarker, welche den funktionellen Zustand des Immunsystems widerspiegeln sind daher von großer Bedeutung nicht nur für optimale Behandlung der Patienten sondern auch für die Entwicklung und Prüfung neuer therapeutischer Ansätze.

 

Die enormen Möglichkeiten der Transkriptom- und Proteomanalyse bieten die technische Voraussetzung für die Etablierung und Validierung entsprechender Biomarker zur funktionellen Charakterisierung des Immunsystems. Wir haben uns in den letzten Jahren auf die Evaluierung von Genexpressionsdaten in der Immundiagnostik konzentriert, da die Expression von akut-induzierten Genen sehr häufig quantitativ mit der synthetisierten Proteinmenge korreliert. Die Analyse der Genexpression mittels mRNA bedarf nicht der Akkumulation einer messbaren Proteinmenge und ist damit auch wesentlich sensitiver und dynamischer. Diese Technik eröffnet eine neue Dimension in der funktionellen Diagnostik, da sie mit sehr geringen Probenmengen auskommt, schnell durchführbar und offen für alle neuen Parameter ist. Die Spezifität einer solchen Analyse wird durch eine Nukleotidsequenz gegeben und ist somit nicht durch die Herstellung von Antikörpern limitiert. Quantitative Genexpressionsanalysen sind außerdem ein äußerst wichtiges Mittel zum Verständnis komplexer biologischer Prozesse. Das Labor ist nach DIN EN ISO 15189 und 17025 akkreditiert. Das Labor führt Prüftätigkeiten (immundiagnostische Funktionstestung von biologischen Arzneimitteln) im Sinne §14 Abs. 4 Nr. 3 AMG durch und unterliegt der regelmäßigen Überwachung nach §64 Abs. 1 AMG durch die Leitstelle Arzneimittelüberwachung Baden-Württemberg. Der EU-GMP-Leitfaden findet dabei Anwendung. Das Labor hat einen Forschungskooperationsvertrag mit der Firma SEARCH-LC GmbH Heidelberg über die Herstellung von Reagenzien für die real-time PCR.

 

 

 

1. Giese, T. 2001. Development of quantitative RT-PCR tests for the expression of cytokine genes on the LightCycler. In Rapid Cycle Real-Time PCR: Methods and Applications. S. Meuer, C. Wittwer, and K. Nakagawara, editors. Springer, Berlin, Heidelberg, New York. 251-261

 

 

 

 

 

 

Wissenschaftliche Aktivitäten der AG

 

Pharmakodynamisches Monitoring der NFAT-abhängigen Genexpression nach Einnahme von Calcineurininhibitoren in der Transplantationsnachsorge.

(Kooperation Nierenzentrum: Prof. Zeier, PD Sommerer)

 

Es handelt sich hierbei um ein neues Laborverfahren, durch das erstmalig das Immunsuppressivum Cyclosporin A in seiner Dosierung individuell angepasst werden kann.

25-30% der Transplantate/transplantierten Patienten überleben einen Zeitraum von 5 Jahren nicht. Transplantatverlust ist Folge von Abstoßungsvorgängen; transplantierte Patienten sterben hauptsächlich an malignen Erkrankungen und Infektionen. Dies sind fast ausnahmslos die Folgen der unzulänglichen Therapie mit Immunsuppressiva, welche einerseits nicht effizient  (Abstoßung) bzw. zu stark sein kann (jede Unterdrückung der Immunabwehr schwächt die Abwehrfunktionen gegenüber Krebs und infektiösen Krankheitserregern). Transplantierte Patienten haben durch die immunsuppressive Therapie ein ca. 4-fach erhöhtes Risiko für maligne Erkrankungen und bei spezifischen Tumoren sogar ein bis zu 100-fach erhöhtes relatives Risiko gegenüber der normalen Bevölkerung. Die geschätzte Inzidenz von malignen Erkrankungen nach 10-jähriger Einnahme von Immunsuppressiva wird auf 20% geschätzt.

Cyclosporin A (CSA) ist eines der am häufigsten verwendeten Immunsuppressiva in der Transplantationsmedizin. CSA unterdrückt präferentiell die Abwehrfunktionen von T-Lymphozyten – letztere sind für die Abstoßungsreaktion hauptverantwortlich, erfüllen gleichzeitig eine zentrale Funktion in der Tumorüberwachung und der Virusabwehr. Das inter-individuelle Ansprechen auf CSA ist hoch variabel. Es gab bisher keine Möglichkeit, diese Variabilität von Mensch zu Mensch durch einen Labortest genau, empfindlich und schnell zu erfassen.

 

Unter Einsatz einer modernen Technologie, der quantitativen RT-PCR, ist es uns weltweit  erstmals gelungen, ein Laborverfahren zu etablieren und mittlerweile auch zu validieren, welches die transkriptionelle Aktivität einiger von CSA beeinflussten Gene quantitativ misst. Es ist eine äußerst „robuste“ Methode: die intra-individuelle Variabilität beträgt bei Testwiederholungen im Verlaufe von 1-Jahreszeiträumen 9%. Das individuelle Ansprechen auf CSA wird nach einem mathematischen Algorithmus als „MRE“ (Minimal Residual Expression) in Prozent ausgedrückt. Bezogen auf einen „Cut-off“ von MRE<15% besitzt dieser Test eine Sensitivität von 80% bei der Identifizierung von Patienten, welche maligne und infektiöse Erkrankungen entwickeln.

 

Das Verfahren wurde mittlerweile an über 1000 Patienten mit Nieren-, Leber- und Herztransplantaten angewendet und evaluiert. Verglichen wurden dabei die individuellen MRE-Werte (Prozent) mit der Inzidenz von Infektionen und malignen Erkrankungen.

>80% der dokumentierten malignen Erkrankungen und Infektionskrankheiten treten bei transplantierten Patienten mit MRE<15% auf. Rund 50% der mit CSA behandelten organtransplantierten Patienten in den hiesigen Ambulanzen haben unter der bisher angewendeten CSA-Therapie MRE-Werte von <15% und sind somit offenbar „über-supprimiert“.

Keiner der bisher zur Steuerung der CSA-Therapie verwendeten Labortests (CSA-Talspiegel; CSA-Peakspiegel/C2-Wert; eingenommene CSA-Dosis) korreliert mit der Inzidenz von Infektionen und malignen Erkrankungen.

In einer kürzlich beendeten kontrollierten Studie an Patienten mit MRE von <15% ist eine Reduktion der CSA-Dosis von 30% (unter gleichzeitigem Anstieg der MRE-Werte über die 15%-Grenze) ohne Verschlechterung der Transplantatfunktion erreicht worden, während in der Kontrollgruppe ein signifikanter Abfall der Nierenfunktion im Untersuchungszeitraum beobachtet wurde.

Das Phänomen der CSA-Resistenz, bisher in der Regel erst nach mehreren Monaten anhand von Abstoßungsreaktionen erkennbar, lässt sich mit diesem Test bereits nach der ersten CSA-Einnahme feststellen. Die unwirksame CSA-Therapie kann sofort beendet und durch andere Therapie-Strategien ersetzt werden.

In Einzelfällen mit beginnenden Komplikationen (Infektion; Lymphome) konnten mittels der jetzt rational steuerbaren Reduktion der CSA-Dosis diese Komplikationen revidiert werden.

 

2. Giese, T., C. Sommerer, M. Zeier, and S. Meuer. 2009. Monitoring immunosuppression with measures of NFAT decreases cancer incidence. Clin Immunol 132:305-11

3. Sommerer, C., T. Giese, S. Meuer, and M. Zeier. 2009. Pharmacodynamic monitoring of calcineurin inhibitor therapy: is there a clinical benefit? Nephrol Dial Transplant 24:21-27.

4. Sommerer, C., W. Hartschuh, A. Enk, S. Meuer, M. Zeier, and T. Giese. 2008. Pharmacodynamic immune monitoring of NFAT-regulated genes predicts skin cancer in elderly long-term renal transplant recipients. Clin Transplant 22:549.

5. Sommerer, C., C. Morath, T. Giese, S. Meuer, and M. Zeier. 2008. Activity of nuclear factor of activated T cells is independent of the number of peripheral lymphocytes in FTY720-treated patients. Transplant Proc 40:1416.

6. Sommerer, C., T. Giese, J. Schmidt, S. Meuer, and M. Zeier. 2008. Ciclosporin A tapering monitored by NFAT-regulated gene expression: a new concept of individual immunosuppression. Transplantation 85:15.

7. Konstandin, M. H., C. Sommerer, A. Doesch, M. Zeier, S. C. Meuer, H. A. Katus, T. J. Dengler, and T. Giese. 2007. Pharmacodynamic cyclosporine A-monitoring: relation of gene expression in lymphocytes to cyclosporine blood levels in cardiac allograft recipients. Transpl Int 20:1036.

8. Sommerer, C., M. Konstandin, T. Dengler, J. Schmidt, S. Meuer, M. Zeier, and T. Giese. 2006. Pharmacodynamic monitoring of cyclosporine a in renal allograft recipients shows a quantitative relationship between immunosuppression and the occurrence of recurrent infections and malignancies. Transplantation 82:1280.

9. Giese, T., M. Zeier, P. Schemmer, W. Uhl, M. Schoels, T. Dengler, M. Buechler, and S. Meuer. 2004. Monitoring of NFAT-regulated gene expression in the peripheral blood of allograft recipients: a novel perspective toward individually optimized drug doses of cyclosporine A. Transplantation 77:339.

10. Giese, T., M. Zeier, and S. Meuer. 2004. Analysis of NFAT-regulated gene expression in vivo: a novel perspective for optimal individualized doses of calcineurin inhibitors. Nephrol Dial Transplant 19 Suppl 4:IV55.

 

 

 

Nicht-invasive Diagnostik der Transplantatabstoßungsreaktion

(Kooperation Chirurgie: Prof.Schmidt)

 

In der Transplantationsnachsorge werden Abstoßungsreaktionen i.d.R. mittels Organbiopsien diagnostiziert, in denen man sich an dem Grad der Infiltration des transplantierten Organs/Gewebes mit immunkompetenten Zellen des Wirtes orientiert. Die histopathologische Diagnostik lässt aber keine funktionellen Rückschlüsse zu sondern ist eine rein morphologische Feststellung. Im Gegensatz dazu ist die Genexpressionsanalyse eine funktionelle Diagnostik, die etwas über den Aktivierungsgrad von Zellen aussagt. Die enorme Empfindlichkeit der PCR-Technologie erlaubt es nun, in vivo aktivierte Zellen, die sich in geringer Zahl im Rahmen von Abstoßungsvorgängen auch im zirkulierenden Blut aufhalten, nachzuweisen. Am Beispiel einer Gruppe Herz transplantierter Patienten hat sich das Potenzial dieses Zuganges bereits als äußerst viel versprechend erwiesen.

 

11. Schöls, M., T.J. Dengler, R. Richter, S.C. Meuer, and T. Giese. 2004. Detection of cardiac allograft rejection by real-time PCR analysis of circulating mononuclear cells. Clin Transplant 18:513-517

 

 

 

Frühe prognostische Marker für Organschädigung nach Lebertransplantation

(Kooperation Chirurgie: Prof.Schmidt)

 

Die Organschädigung durch Ischämie nach Explantation wird als wichti­ger Risikofaktor für frühe Komplikationen nach Transplantation angesehen. Der Ischä­mie­schaden beruht auf komplexen pathophysiologischen Mechanismen, in welche En­do­thel­schädigung, Radikalbildung und pro-inflammatorische Zytokine involviert sind. Die Schädi­gung führt zu Organdysfunktion und zur Aktivierung des Immunsystems, mit nachfol­genden Abstoßungsreaktionen. Kein dia­gnostischer Parameter erlaubt derzeit eine klinische Prog­nose des Transplantats bezüglich des Grads der Organschädigung. Die gegenwärtig prakti­zierte pathomorphologische Analyse der Reperfusionsbiopsie sowie der Anstieg der Tran­saminasen in der frühen post-operativen Phase korrelieren nur ungenügend mit dem weiteren klinischen Verlauf und wer­den deshalb nicht routinemäßig als therapeutische Ent­scheidungshilfe herangezogen. Wir konnten in den Biop­sien unmittelbar nach Reperfusion Gene identifizieren, deren Expression das individuelle Risiko einer Frühkomplikation nach Transplantation vorhersagen können. Interessanterweise waren neben den pro-inflammatori­schen Genen TNF-a und CRP, die Expression von weiteren 5 Genen mit pathophysiologi­scher Relevanz bei einer Endothel­schädigung verändert. Damit wurde auch erstmalig bei Patienten der Zusammenhang zwischen Ischämieschaden und klinisch relevanter Komplika­tion gezeigt. Mittels eines Risiko-Scores konnten Komplikationen mit einer Sensitivität von 96% und einer Spezifität von 74% voraus­gesagt werden.

 

12. Berberat, P.O., H. Friess, B. Schmied, M. Kremer, S. Gragert, C. Flechtenmacher, P. Schemmer, J. Schmidt, T. Kraus, W. Uhl, S. Meuer, M.W. Buchler, and T. Giese. 2006. Differentially expressed genes in postperfusion biopsies predict early graft dysfunction after liver transplantation. Transplantation 82:699-704. 

 

 

 

Objektive Messung der Entzündungsaktivität bei chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen

(Kooperation mit der Klinik für Innere Medizin Universität Jena: Prof. Stallmach, PD Schmidt)

 

Es gibt zum Nachweis früher entzündlicher Reaktionen keine empfindlichere Technologie als die Genexpressionsanalyse aus Gewebe/Biopsien. Wir haben dies anhand von Untersuchungen von Darmschleimhautbiopsien bei Patienten mit Morbus Crohn und Colitis Ulcerosa evaluiert und festgestellt, dass es möglich ist, damit die Effizienz von immunmodulatorischen Therapien zu beurteilen, als auch prognostische sehr frühe Aussagen über mögliche Rezidivgefahren zu treffen.

 

13. Zahn, A., T. Giese, M. Karner, A. Braun, U. Hinz, W. Stremmel, and R. Ehehalt. 2009. Transcript levels of different cytokines and chemokines correlate with clinical and endoscopic activity in ulcerative colitis. BMC Gastroenterol 9:13.

14. Schmidt, C., E. Kasim, W. Schlake, G. Gerken, T. Giese, and A. Stallmach. 2009. TNF-alpha antibody treatment in refractory collagenous sprue: report of a case and review of the literature. Z Gastroenterol 47:575.

15. Schmidt, C., W. Hauser, T. Giese, and A. Stallmach. 2007. Irritable pouch syndrome is associated with depressiveness and can be differentiated from pouchitis by quantification of mucosal levels of proinflammatory gene transcripts. Inflamm Bowel Dis 13:1502.

16. Schmidt, C., T. Giese, E. Hermann, S. Zeuzem, S. C. Meuer, and A. Stallmach. 2007. Predictive value of mucosal TNF-alpha transcripts in steroid-refractory Crohn's disease patients receiving intensive immunosuppressive therapy. Inflamm Bowel Dis 13:65.

17. Schmidt, C., T. Giese, R. Goebel, M. Schilling, T. Marth, A. Ruether, S. Schreiber, S. Zeuzem, S. C. Meuer, and A. Stallmach. 2007. Interleukin-18 is increased only in a minority of patients with active Crohn's disease. Int J Colorectal Dis 22:1013.

18. Schmidt, C., T. Giese, B. Ludwig, M. Menges, M. Schilling, S. C. Meuer, S. Zeuzem, and A. Stallmach. 2006. Increased cytokine transcripts in pouchitis reflect the degree of inflammation but not the underlying entity. Int J Colorectal Dis 21:419.

19. Schmidt, C., T. Giese, B. Ludwig, I. Mueller-Molaian, T. Marth, S. Zeuzem, S. C. Meuer, and A. Stallmach. 2005. Expression of interleukin-12-related cytokine transcripts in inflammatory bowel disease: elevated interleukin-23p19 and interleukin-27p28 in Crohn's disease but not in ulcerative colitis. Inflamm Bowel Dis 11:16.

20. Maul, J., C. Loddenkemper, P. Mundt, E. Berg, T. Giese, A. Stallmach, M. Zeitz, and R. Duchmann. 2005. Peripheral and intestinal regulatory CD4+ CD25(high) T cells in inflammatory bowel disease. Gastroenterology 128:1868.

21. Autschbach, F., S. Eisold, U. Hinz, S. Zinser, M. Linnebacher, T. Giese, T. Loffler, M. W. Buchler, and J. Schmidt. 2005. High prevalence of Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis IS900 DNA in gut tissues from individuals with Crohn's disease. Gut 54:944.

22. Stallmach, A., T. Giese, C. Schmidt, B. Ludwig, I. Mueller-Molaian, and S.C. Meuer. 2004. Cytokine/chemokine transcript profiles reflect mucosal inflammation in Crohn's disease. Int J Colorectal Dis 19:308-315.

23. Stallmach, A., T. Giese, C. Schmidt, S.C. Meuer, and S.S. Zeuzem. 2004. Severe anaphylactic reaction to infliximab: successful treatment with adalimumab - report of a case. Eur J Gastroenterol Hepatol 16:627-630.

24. Stallmach, A., T. Giese, C. Schmidt, B. Ludwig, S. Zeuzem, and S. Meuer. 2003. Markers for disease activity in ulcerative colitis. Digestive Surgery 20:350.

25. Giese, T., and A. Stallmach. 2003. Genexpression als diagnostischer Marker in der klinischen Praxis. Biospektrum 9:652-653.

 

 

 

Immunmodulierende Wirkung von intravenösen Immunglobulinen (IVIg)

(Kooperation Neurologie: Dr. Jacobi; Labor Prof. Watzl und Octapharma AG)

 

IVIg werden therapeutisch zur Behandlung humoraler Immundefekte eingesetzt. Effekte von IVIg auf immunvermittelte Entzündungskrankheiten (IMID) wurden erstmals in den 1950er Jahren bei Immunthrombozytopenien beschrieben. Seither haben zahlreiche klinische Studien eine Wirksamkeit von IVIG bei IMiDs wie Guillain-Barré-Syndrom, Kawasaki-Syndrom, chronisch entzündlicher demyelinisierender Polyneuropathie, Myasthenia gravis und Kortikosteroid-resistenter Dermatomyositis bestätigt. Experimentell gibt es mehrere Theorien, letztlich  ist aber der zugrunde liegende Mechanismus der Immunmodulation durch IVIg in vivo weitgehend unbekannt. Eine Modulation von verschiedenen Komponenten des Immunsystems ist wahrscheinlich. Kürzlich beschrieben wir die Modulation von NK-Zellen durch IVIg. IVIg bewirkt eine unspezifische Degranulierung von NK-Zellen und damit eine Abnahme ihrer zytotoxischen Aktivität in vivo und in vitro. Nach IVIg- Gabe kommt es zu einem Abfall der NK-Zellen im peripheren Blut, zu einem Anstieg von Interferon-g im Plasma und zu einer Abnahme ihrer zytotoxischen Aktivität. Gegenwärtig prüfen wir in einer multi-zentrischen klinischen Studie (EudraCT: 2008-004579-22), ob der Grad der Immunmodulation durch IVIg mit dem Ansprechen von MS-Patienten auf eine IVIg Therapie in Zusammenhang steht und somit durch Immunmonitoring die Möglichkeit einer individuell angepassten Therapie möglich wäre.

 

26. Jacobi, C., M. Claus, B. Wildemann, S. Wingert, M. Korporal, J. Romisch, S. Meuer, C. Watzl, and T. Giese. 2009. Exposure of NK cells to intravenous immunoglobulin induces IFN gamma release and degranulation but inhibits their cytotoxic activity. Clin Immunol 133:393.

 

 

Select languageSelect language
Print Mail