Neonatologie

Forschung der Abteilung Neonatologie des Universitäts-Klinikums Heidelberg

Die Forschung der Abteilung befasst sich mit verschiedenen Aspekten der Verbesserung der Intensivmedizin und allgemeinen Betreuung Frühgeborener und reifer Neugeborener. Zentrales Anliegen der Forschung ist die Vermeidung von Hirnschäden und Entwicklungsschäden

Erforschung der angeborenen zellulären Immunologie

1.     Molekulare Mechanismen der Leukozytenrekrutierung

2.     Therapeutische Interventionen in der Entzündung und Sepsis

3.     Fetale Entwicklung der Leukozytenrekrutierung

 

Dr. David Frommhold (Leiter der AG), Dr. Kirsten Buschmann,  Natascha Braach (PhD Studentin), Raphaela Tschada (cand. med.), Johanna Pflaum (cand.med.) Melitta Weissinger (MTA)

Prof. Dr. Johannes Pöschl (Direktor der Klinik f. Neonatologie)

 

Hintergrund

Die Leukozytenrekrutierung ist ein mehrstufiger Vorgang, beginnend mit der Bindung frei fließender Leukozyten an das Endothel, gefolgt vom Rollen der Leukozyten, welches durch Selektine, eine Familie von Adhäsionsmolekülen, und ihre Liganden vermittelt wird. Leukozytäre Interaktionen mit endothelial gebundenen Chemokinen führen zur Aktivierung von Integrinen, die an ihre Rezeptoren auf der Endotheloberfläche binden und die feste Adhäsion an das Endothel bewirken. Nun können die Leukozyten durch die Gefäßwand ins Gewebe auswandern.

 

Methoden

  • Intravitalmikroskopie der Maus (Muskel, Darm, fetaler Dottersack) als Durchlicht oder Mehrkanalfloureszenzverfahren
  • Mausentzündungsgmodelle: Cremastermodelle, LPS ALI, Thioglykollate induzierte Peritonitis, LPS induzierte Sepsis, LPS Amnionitis, Ovalbumininduziertes Asthma bronchiale
  • Microchirurgie an der Maus
  • In-vitro/ex-vivo Mikroflusskammerexperimente und Transmigrationsassays
  • FACS (LSRII)
  • PCR, RT-PCR
  • Western Blotting
  • Immunhistochemie in-vivo/in-vitro

Forschungsprojekte

Rolle der posttranslationalen Glykosylierung für die zelluläre Abwehr

Leukozytenrollen- und adhäsion in entzündetem Gewebe und Lymphknoten ist im Gegensatz zur milzabhängigen Immunreaktion von der Zufuhr von Fukose für die posttranslationale Glykosylierung über den GolgiGDP-Fukosetransporter abhängig[1,2].

Nachdem auch für die Sialyltransferase ST3Gal-IV im Rahmen der posttranslationalen Glykosylierung eine gewisse Kontrolle des selektinabhängigen Leukozytenrollens nachgewiesen wurde, konnte nun eine entscheidende Rolle dieses Enzyms bei der chemokinvermittelten Leukozytenadhäsion aufgedeckt werden[3].

 

Rolle von RAGE für die Leukozytenrekrutierung in der Entzündung

Wir konnten belegen, dass RAGE (Receptor for Advanced Glycation Endproducts) ein entscheidender Entzündungsmediator ist, indem es an das b2-Integrin Mac-1 bindet  und dadurch zusammen mit ICAM-1 die Leukozyenrekrutierung vermittelt[4]. In einem aktuellen Projekt konnte gezeigt werden, dass die Art der Kooperation von RAGE mit ICAM-1  und entsprechende Interaktion mit deren Integrinen Mac-1 und LFA-1 stimulusabhängig ist[5].

 

Rolle der Tyrosinkinase Syk bei der integrinabhängigen Leukozytenadhäsion

Im Zuge der integringesteuerten Vermittlung der festen Adhäsion von Leukozyten am entzündeten Gefässendothel sorgt die Tyrosinkinase Syk für die Signaltransduktion in den Leukozyten und bereitet damit die erfolgreiche Auswanderung von Leukozyten ins Gewebe vor[6,7].

 

Untersuchung anti-inflammatorischer Eigenschaften von Protein C

Zymogen Protein C blockiert  in in vivo Entzündungsmodellen des Cremastermuskels, LPS induziertem ALI, LPS induzierter Sepsis sowohl die Leukozytenadhäsion als auch die nachfolgende -transmigration, nicht aber das Leukozytenrollen. Die antiinflammatorische Wirkung von Protein C ist dabei klar dosis- und zeitabhängig sowie abhängig von Schlüsselmolekülen des Protein C pathways (Thrombomodulin, EPCR, PAR-1). Durch die schnelle und suffiziente Aktivierung von Protein C ergibt sich ein ähnliches anti-entzündliches Potential wie bei Behandlung mit aktiviertem Protein C. Ferner kann eine signifikante Verbesserung des Überlebens durch die Protein C Behandlung (100U/kg 3x) der Mäuse mit LPS induzierter Sepsis von 25% auf etwa 75% nachgewiesen werden[8]. ICAM-1 konnte als ein wichtiges Adhäsionsmolekül zur Vermittlung antiinflammatorischer Eigenschaften von Protein C identifiziert werden[8]. Es zeigte sich jedoch, je nach Art und Modell der Entzündung eine zusätzliche, ICAM-1 unabhängige Hemmung der Leukozytenrekrutierung, in die möglicherweise andere Adhäsionsmoleküle involviert sind, was Gegenstand weiterer Projekte ist.

 

Untersuchung der fetalen Entwicklung der Leukozytenrekrutierung in-vivo

In diesem Projekt wird mittels eigens entwickeltem Modell per Intravitalmikroskopie an der schwangeren Maus die Leukozytenrekrutierung in Mausfeten in unterschiedlichem Entwicklungsstand untersucht. Damit soll u.a. die leukozytäre Fähigkeit zur Rekrutierung unter inflammatorischer Stimulation im Laufe der Schwangerschaft beobachtet werden.

 

Untersuchung der Mechanismen der Leukozytenrekrutierung bei Früh- und Neugeborenen

In diesem Projekt sollen Mikroflusskammerexperimente durchgeführt werden, bei denen in vorgegebener Geschwindigkeit  eine Mikrokapillare, die mit bestimmten Adhäsionsmolekülen beschichtet ist, mit humanen Nabelschnurleukozyten perfundiert wird. Bei Früh- und Neugeborenen mit und ohne proinflammatorischer Immunlage (z.B. Infektion) können dadurch die in-vivo Verhältnisse von Leukozytenrollen und -adhäsion simuliert werden und vermittelnde Adhäsionsmoleküle in der frühen Entwicklung des Menschen aufgedeckt werden.

 

Literatur

 


 

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Molekulare und zelluläre Mechanismen in der adulten und neonatalen Sepsis

Dr. Lutz Koch (Leiter der AG), Claudia Felbinger (MTA), Prof. Dr. Johannes Pöschl (Ärztlicher Direktor)

 

Hintergrund

Die Sepsis ist nach wie vor eines der Hauptprobleme der Intensivmedizin, vor allem aber der Neugeborenenmedizin. In Westeuropa und USA erkranken 1-4 von 1000 Lebendgeborenen an einer neonatalen Sepsis. An den Komplikationen dieser oftmals foudroyant verlaufenden Infektion versterben 10-25% der Patienten. Wie eine Reihe von epidemiologischen Untersuchungen belegt, hat die Inzidenz der neonatalen Sepsis in den letzten 20 Jahren zugenommen.

Lipopolysaccharid (LPS) spielt eine Schlüsselrolle in der Pathogenese der gram-negativen Sepsis, in dem es die Ausschüttung einer großen Anzahl von inflammatorischen Mediatoren induziert. Die intrazellulären Transkriptationsfaktoren Nuclear factor-kappa B (NF-κB) und p38 mitogen-activated protein kinase (MAPK) sind maßgeblich an diesem Prozeß beteiligt. Es konnte gezeigt werden, dass überschießende und verlängerte Aktivierung von NF-κB eine Vielzahl von ernsten inflammatorischen Erkrankungen auslöst, wie z.B. septischer Schock, akutes Lungenversagen, Ischämie und Reperfusionsschaden. Die Hemmung von NF-κB in Endotoxinschock-Modellen hat einen positiven Effekt auf die Überlebensrate. Eine ähnliche Funktion wie NF-κB hat p38 MAPK. Es reguliert die Expression von einer großen Zahl an proinflammatorischen Zytokinen, die in die Akutphasereaktion der Inflammation  involviert sind, wie z.B. TNF-α und IL-6. Hemmung von p38 MAPK hat ebenfalls einen breiten anti-inflammatorischen Effekt während der Endotoxinämie.

 

Forschungsprojekte

Ziel der Arbeiten ist die Erforschung molekularer und zellulärer Mechanismen in der adulten und neonatalen Sepsis mit Schwerpunkt auf deren unterschiedlichen Verlauf. Dies soll mit zur Aufklärung beitragen, warum Neugeborene einen oftmals foudroyanten Verlauf haben. Zur Hypothesengenerierung wurde eine Genexpressionsanalyse mittels Affymetrix-microarray-Technik in adulten und neonatalen Blut nach LPS-Stimulation durchgeführt. Da sich Unterschiede im Expressionmuster von NF-κB, p38 MAPK und inflammatorischen Zytokinen zeigten, wurde im nächsten Schritt die Veränderungen von NF-κB-, p38 MAPK- und Zytokin-Expression mittels FACS-Analysen gemessen. Es konnte mittels simulierter Sepsis gezeigt werden, dass im Blut Neugeborener der p38 MAPK-Pathway und die Expression von TNF-α im Vergleich zu Erwachsenen deutlich eingeschränkt ist. Spezifische Hemmung von p38 MAPK verminderte signifikant die Expression der proinflammatorischen Cytokine TNF-α und Il-6 in adulten und neonatalen Blut. Die Gerinnungsanalysen mittels Thrombelastographie (TEG) komplettieren die in-vitro Experimente... Es zeigte sich, dass TEG eine sensitive und zuverlässige Methode ist, um LPS-induzierte Veränderungen der Gerinnung in neonatalen und adulten Blut zu messen.

 

 

Literatur unter: http://www.researcherid.com/rid/H-2166-2011

 


 

Funktion von DMBT1 bei der angeborenen Immunabwehr, Inflammation und Angiogenese

Dr. Hanna Müller (Leiterin der AG), Sebastian Ronellenfitsch (Doktorarbeit), Volker Gebhardt (Doktorarbeit), Prof. Dr. Johannes Pöschl (Direktor der Klinik)

 

Hintergrund

Das Gykoprotein DMBT1 (Deleted in Malignent Brain Tumors 1) ist der Gruppe B der Familie der scavenger receptor cysteine-rich (SRCR)-Proteine zugehörig. Entdeckt wurde das zugehörige Gen DMBT1 auf Chromsom 10q26.13 als potentielles Tumorsuppressor-Gen in Gehirntumoren (Medulloblastoma, Glioblastoma multiforme). In den darauffolgenden Jahren erkannte man, dass die Proteine salivary agglutinin (SAG) und Glykoprotein-340 (gp-340) unterschiedliche alternative Splicing-Formen von DMBT1 sind. Bei verschiedenen Tieren ist DMBT1 unter den Namen CRP-ductin and Muclin (Maus), Ebnerin (Ratte) und Hensin (Kaninchen) bekannt.

Das Protein DMBT1 ist in verschiedenen Organen (z.B. Lunge, Darm) Teil der angeborenen Immunabwehr: Es kann unterschiedliche Bakterien und Viren binden, es stimuliert Makrophagen und es bindet an andere Proteine des angeborenen Immunsystems (z. B. Surfactantprotein A und D, sekretorisches IgA, Komplementfaktor C1q). Dmbt1-/- Mäuse sind anfälliger für eine induzierte. Zudem hat DMBT1 Funktionen bei der Differenzierung von Epithelien und Stammzellen und bei regenerativen Prozessen.

 

Forschungsprojekte

 

Funktionen von DMBT1 bei der angeborenen Immunabwehr und der Inflammation

Die DMBT1-Expression in der Lunge des humanen Feten, Früh- und Neugeborenen nimmt mit steigendem Gestationsalter und mit höherem postnatalen Alter zu. DMBT1 wird dabei in den Lungenepithelzellen und den peribronchialen Drüsen exprimiert. Bei einer Infektion/Sepsis wird DMBT1 50-fach hochreguliert wird und ist dann auch in den hyalinen Membranen zu finden. In vitro Untersuchungen mittels capillary surfactometer weisen nach, dass humanes rekombinantes DMBT1 imstande ist, zwei verschiedene, in der Neonatologie verwendete Surfactantpräparate abhängig von der hrDMBT1-Konzentration zu inaktivieren, was durch Zugabe von Calcium verhindert werden kann.

Eine DMBT1-Expression ist auch im kardiovaskulären System zu beobachten. Beim Krankheitsbild der bakteriellen Endokarditis zeigt sich das Protein DMBT1 auf den betroffenen Herzklappen, wobei es sehr deutlich bei den Bakterienkolonien nachzuweisen ist. Die DMBT1-Expression korreliert mit der Aggressivität der Bakterien, die die Endokarditis verursachen. Auch bei den granulozytenarmen Fibrinogen/Fibrin-Ablagerungen der Vegetationen und bei den atheromatösen Beeten ist DMBT1 zu detektieren. In vitro zeigt sich eine Bindung von DMBT1 an Fibrinogen und Fibrin, aber auch an Erythrozytenmembranen und Thrombozyten. Ebenso kann eine Induktion der Erythrozytenaggregation durch hrDMBT1 bei Anwesenheit von Calcium im Aggregometer beobachtet werden.

 

Funktionen von DMBT1 bei der Angiogenese

DMBT1 ist vor allem in der extrazellulären Matrix der Endothelzellen zu finden, aber auch intrazellulär zu lokalisieren. DMBT1 ist wichtig bei der Proliferation, Migration und Adhäsion von Endothelzellen. Zudem zeigt DMBT1 pro-angiogentische Eigenschaften, indem es die „tube formation“ und das Aussprossen der Endothelzellen fördert. In vivo lässt sich bei der Dmbt1-/- Maus beim Hinterbeinischämie-Versuch eine deutlich geringere Perfusion des ligierten Beines nach 14 Tagen beobachten; im betroffenen Muskelgewebe sind bedeutend weniger Kapillaren und Arteriolen nachzuweisen. Bei der pro-angiogenetischen Funktion von DMBT1 scheinen der Notch-Signalweg und die Fähigkeit von DMBT1 mit Galectin-3 zu interagieren und an Wachstumsfaktoren wie VEGF (vascular endothelial growth factor) und EGF zu binden, von Bedeutung zu sein.

 

Literatur

 


 

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