Kliniken & Institute ... Kliniken Frauenklinik (Zentrum) ... Gynäkologische... Über uns Sektion für... Ärzte

Für Ärzte

Sektion Reprodiuktionsgenetik

Rudolph Virchov erkannte zuerst, das der Ursprungsort jeder klinisch diagnostizierten Pathologie die Zelle ist (Zelluläre Pathologie). Dies spiegelt sich wieder in der Zell-spezifischen Gen-Expression, reguliert über die zell-spezifische Vernetzung der dazu gehörigen Gene auch „signal pathways“ oder „genetic networks“ genannt.

Aber nicht jede Veränderung der DNA-Sequenz (d.h. Mutation) führt direkt zu einer klinisch erkennbaren Pathologie. Deshalb kennen wir viele klinische Syndrome mit männlicher oder weiblicher Infertilität in unterschiedlichen Erscheinungsformen. Bekannte Beispiele sind die Androgen-Resistenz-Syndrome und die congenitale Aplasie der Vas Deferenz (CBAVD), die oft, aber eben nicht immer mit der bekannten somatischen Krankheit „Mukoviszidose“ oder „Zystische Fibrose“ einhergeht:

Ganz allgemein lässt sich heute abschätzen, dass die Anzahl der Gene, die beim Menschen direkt oder indirekt die Fertilität beeinflussen bei etwa 3000-5000 liegt. Sie lassen sich grob in 3 Gruppen aufteilen:

  • Gene, die nur in der Keimbahn exprimiert werden,
  • Gene, die nur oder auch in den Gonaden exprimiert werden und
  • Gene, die auch in der Ontogenese, z.B. während des „Imprintings“ und der Implanatation in der frühen Embryogenese aktiv sind

Es ist vor allem die letzte Fallgruppe, die bei der Anwendung moderner Verfahren der künstlichen Befruchtung kritisch fragen lässt, inwieweit man dabei auch das Risiko eingeht, dass die genetisch bedingte Infertilität des Paares auf deren Nachkommenschaft übertragen wird bzw. dass zusätzliche somatische Pathologien erzeugt werden, die bei den Eltern noch nicht vorhanden, bzw. noch nicht erkennbar vorhanden waren.

Aus dem Blickwinkel des Grundlagenwissenschaftlers muss man deshalb natürlich fordern, dass jede Form von kausaler molekulargenetischer Diagnostik weiblicher oder männlicher Infertilität direkt mit den männlichen und weiblichen Keimzellen durchgeführt wird. Dies ist in der klinischen Routine-Versorgung der Patienten aber nur möglich, wenn die klinische Vor-Diagnose eine medizinische Indikation für die Gewinnung von Keimbahngewebe ergeben hat. Die molekular- und cyto-genetische Diagnostik im Labor basiert deshalb in der Regel zuerst auf einer Blutprobe des Patienten wo die Gewinnung von DNA und RNA, bzw. den Chromosomen aus den kernhaltigen Blutzellen, den Leukozyten, erfolgt. Dazu müssen 20 ml Vollblut in einem EDTA-Röhrchen ins Labor geschickt werden.

Die Einsendung dieser Blutprobe schliesst ebenfalls den zugehörigen Anamnese-Fragebogens, ausgefüllt mit allen klinischen Daten und Kopien der bereits erhobenen Befunde, als Beilage ein.

AZF-Gen-Diagnostik

In unserem molekulargenetischen Diagnostiklabor wurde auf der männlichen Seite bei:

  • Patienten mit nicht-obstruktiver Azoospermie und SCO Syndrom
  • Idiopathischer Oligozoospermie (5-10 Millionen Spermien pro Ejakulat),
  • OAT-Syndrom

Die molekulare Diagnostik der AZFa, b, c Bruchpunkte in Yq11 und der 13 Gene in AZFa, b, c etabliert. Durch die Verwendung von PCR-Multiplex-Systemen wird dabei ein kostengünstiges molekulares Diagnostik-System mit Europäischem Qualitätsstandard angeboten, was dennoch eine komplexe Gen-Deletionsdiagnostik erlaubt. Positive und negative Kontrollexperimente im Parallelansatz sorgen für eine transparente und damit rasche Identifizierung potentieller technischer Fehlerquellen. Mit diesem System dienen wir als Referenzlabor dem europäisch koordinierten EMQN-Qualitätsmanagement.

Erste Richtlinien für eine einfache AZF-Deletionsdiagnostik mit 6 PCR-Duplex-Ansätzen wurden publiziert (Simoni et al. 1999). Für die für die Klinik wichtigste Diagnostik kompletter AZF-deletionen muß diese aber in der Regel durch minimal 2, maximal 6 weitere PCR-Duplex oder Simplex-Ansätze erweitert werden.

Diese 2-stufige genomische AZF-Deletionsdiagnostik kann nun, nachdem die humane Y-DNA Sequenz komplett bekannt ist (Skaletsky et al.2003), durch eine gezielte AZF-Bruchpunkt und AZF-Gendiagnostik wesentlich verbessert werden.

Für die Klinik ist insbesondere die Differentialdiagnostik kompletter und partieller AZFa und AZFb Deletionen wichtig (Vogt, 2005a).

Nur komplette Deletionen lassen eine Prognose auf die zu erwartende testikuläre Pathologie im Hodenepithel des Patienten zu.

Nur komplette AZFa Deletionen führen zu einer kompletten Keimzell-Aplasie, auch Sertoli-Cell-Only-Syndrom genannt, komplette AZFb Deletionen zu einem meiotischen Arrest. Postmeiotische Keimzellen werden in beiden Fällen nicht im Hodenepithel dieser Patienten gefunden. Partielle AZFa und AZFb Deletionen mit variablen histologischen Bildern in Hodenschnitt-Präparaten der betroffenen Patienten weisen darauf hin, daß diese Deletionen kausal nicht immer  für die Infertiliät des Patienten verantwortlich sind.

Komplette AZFc Deletionen führen in der Regel zu einer Reduktion der Spermienzahl des Patienten unter 5 Millionen (Krausz et al. 2003). Aber nicht alle Männer mit AZFc Deletion sind infertil. In der Literatur wird auch die Transmission einer kompletten AZFc Deletion vom Vater auf die Söhne mehrfach beschrieben. Die positive Diagnostik von partiellen oder kompletten AZFc-Deletionen gibt in der Klinik in der Regel eine gute Prognose für das Auffinden von reifen Spermien im Hodengewebe nach TESE.

AZFc-Deletionen, die kausal zu einer hochgradigen Oligozoospermie, oder sogar Azoospermie beim Mann führen, werden zu 100% auf die männliche Nachkommenschaft übertragen, d.h. die Söhne dieser Väter sind von Geburt an steril. Daß diese AZF-Deletionen dann auch zu einem vollständigen Verlust des Y Chromosoms und damit zu X0 Zellen in der frühen Embryogenese des Kindes führen können, lässt sich zur Zeit nicht ausschließen (Vogt, 2005a). Die entstehenden Mosaik-Karyotypen: 45,X0/46,XY werden in der Fachliteratur kausal für das Erscheinen von dysgenetischen Gonaden, für das Turner Syndrom, und für weitere somatische Pathologien verantwortlich gemacht (Chang et al. 1990). Vor der Anwendung klinischer Befruchtungsverfahren sollten deshalb Männer mit AZFc-Deletionen bei Kinderwunsch auf diese generelle strukturelle Instabilität des AZF Locus auf ihrem Y-Chromosom hingewiesen werden.

Gonadoblastom Risiko bei Frauen mit Dysgenetischen Gonaden

Frauen mit gestörter Gonadenentwicklung (Gonaden-Dysgenesie) haben oft keine zwei X Chromosomen, sondern nur eins oder, statt dem zweiten X Chromosom, ein Y Chromosom im Chromosomensatz ihrer Leukozyten. Daraus lässt sich schliessen, dass wohl insbesondere X und Y Chromosom bereits im embryonalen Gonadengewebe und in den embryonalen Keimzellen von Mann und Frau aktiv sind und zur Stabilisierung der geschlechtsspezifischen Gonadenentwicklung beitragen. Ihre molekularen Bausteine und deren genetisches Regelwerk sind allerdings weitgehend unbekannt. Aus dem variablen Erscheinungsbild der verschiedenen Gonaden-Dysgenesien lässt sich aber schliessen, dass dieses Regelwerk vermutlich leicht destabilisiert werden kann.

Diese Vorstellung wird unterstützt durch die Tatsache, das Gonadentumore bestehend aus Keimzellen und den umgebenden Körperzellen (d.h. Gonadoblastome, Dysgerminome, Seminome) fast ausschliesslich (zu 96%) in den dysgenetischen Gonaden von Patienten mit einem Y Chromosom im Chromosomensatz zu finden sind. Das Risiko für die Bildung eines Gonadoblastoms wird bei diesen Frauen in der Literatur mit über 30% angegeben. In der Klinik wird diesen Patienten in der Regel deshalb prophylaktisch eine komplette Gonadenentfernung vor der Pubertät empfohlen. Dabei stellt sich aber nun die Frage, ob tatsächlich die pure Anwesenheit des Y-Chromosoms in den Gonadenzellen der Patientin ausreicht, ihr dieses hohe Gonadoblastom-Risiko zu bescheinigen, oder ob es nicht eher von der genetischen Aktivität eines oder mehrer Y-Gene im sogenannten Gonadoblastoma Locus auf diesem Chromosom (GBY) abhängt, dass sich diese Tumorzellen entwickeln.

Im Rahmen des Lübecker Forschungs-Netzwerks “Disorders of Sex Development (DSD)“ gefördert im Schwerpunkt „Seltene Erkrankungen“ des Bundesministeriums für Bildung und Forschung (BMBF) wurde im Universitätsklinikum Heidelberg ein diagnostisches Netzwerk für die kontinuierliche ärztliche Begleitung von Kindern, Jugendlichen und Frauen mit dysgenetischen Gonaden zwischen der Sektion der Pädiatrischen Endokrinologie und Diabetologie der Kinderklinik und der Hormonambulanz der Abteilung Gynäkologische Endokrinologie und Fertilitätsstörungen der Frauenklinik (Spezialsprechstunde „Kinder und Jugendendokrinologie“) mit dem molekulargenetischen Forschungslabor unserer Sektion etabliert.

Im Rahmen dieser Netzwerk-Studie soll bei allen Patienten  mit dysgenetischen Gonaden und Y Chromosom in den Leukozytenkernen (DSD-Y Subgruppe) das tatsächliche Risiko der Entwicklung von Gonadoblastomen und Dysgerminomen im Gonadengewebe über eine diagnostische Expressionsanalyse der sogenannten GBY-Kandidatengene in diesem Gewebe, mit und ohne Tumorzellen, experimentell evaluiert werden. Eine entsprechende GBY-Expressionsanalyse in den Leukozyten der gleichen Patientengruppe wird parallel durchgeführt, um den potentiellen Nutzen dieser leicht zugänglichen Blutzellen für eine zukünftige klinische Gonadoblastom-Risikodiagnostik -bereits aus einer Blutprobe und vor der geplanten Gonadotektomie- kritisch zu überprüfen. Werden signifikant unterschiedliche Expressionsprofile eines GBY Kandidatengens im Gonadengewebe einer Frau, mit und ohne Gonadoblastom, gefunden und auch in den Leukozyten der betreffenden Patientin reproduziert, kann dieser Befund in Zukunft für die Klinik als molekularer „Biomarker“ für eine deutlich verbesserte Prognose des tatsächlichen Gonadoblastom-Risikos in der klinisch heterogenen Gruppe der DSD-Y Patienten etabliert werden. Eine Entfernung der Keimdrüsen durch einen operativen Eingriff würde dann oft überflüssig.

Ablauf der Untersuchung

In einer gründlichen klinischen Untersuchung wird zuerst das klinische Bild der individuellen Gonaden-Anomalie detailliert festgehalten. Im Rahmen der sogenannten GBY-Studie werden dann die Blutzellen von maximal 25 ml Blut (1x20 ml und 1x 5 ml) benötigt und gegebenenfalls das Restgewebe einer medizinisch indizierten Gonadenbiopsie.

Nutzen/Risiken

Durch diese Untersuchung entstehen für den Patienten keine über das Standardabklärungsprogramm hinausgehende Risiken. Alle genetischen Untersuchungen können aus den Zell-Kernen von Blutproben durchgeführt werden. Selbstverständlich wird das aus den Blutzellen gewonnene genetische Material (DNA und RNA) nicht zur Durchführung sonstiger genetischer Analysen verwendet. Ein direkter Nutzen, der für den Patienten ein Fortschritt in der Möglichkeit der weiteren klinischen Behandlung sein könnte, wäre, dass das Risiko, in späteren Jahren ein Gonaden-Blastom zu bekommen, aufgrund dieser Studie, geringer als bisher angegeben werden könnte, bzw. die übliche Empfehlung einer operativen Entfernung der Keimdrüsen entfallen würde.

Selbstverständlich ist die Teilnahme an dieser GBY-Studie freiwillig. Sie kann jederzeit ohne Angabe von Gründen und ohne Nachteile für die weitere medizinische Versorgung zurückgezogen werden. Alle gesammelten Daten, wie auch die Blut-, DNA- und RNA-Proben werden dann vollständig vernichtet. Die Vorschriften über die ärztliche Schweigepflicht und den Datenschutz, insbesondere hinsichtlich aller personenbezogenen Daten, werden im Rahmen dieser Studie eingehalten. Außer den beteiligten Ärzten erhalten keine weiteren Personen Einblick in die Originalkrankenunterlagen.

Bei der Zusendung der EDTA-Blutprobe in unser Labor ist es notwendig, den zugehörigen klinischen Anamnese Bogen vollständig aus zu füllen und gegebenenfalls Kopien der bereits erhobenen Befunde beizulegen.

POF-Syndrom-genetische Diagnostik

Im Rahmen einer Forschungsstudie wurde die genetische Diagnostik einer Serie von Schlüsselgenen für die Follikulogenese: BMP15, DAZL, DBX, FMR1, FOXL2, GDF9A, INHa, USP9X, bei Patienten mit idiopathischem POF-Syndrom etabliert.

Die Teilnahme an dieser Studie ist für den Arzt und die Patienten kostenlos.

Erstes Ziel dieser Studie war die Etablierung von POF-Patienten-Subgruppen, um die große symptomatische Heterogenität dieses Krankheitsbildes auch bereits klinisch aufzugliedern (Fassnacht et al. 2006). Eine hypergonadotrope Ovarialinsuffizienz findet sich bei 5% der Frauen unter 45 Jahren. Tritt diese Ovarialinsuffizienz unter 40 Jahren auf, so spricht man definitionsgemäß von einer vorzeitigen Ovarialinsuffizienz, oder POF-Syndrom (premature ovarian failure). Das POF-Syndrom findet sich bei ca. 1% der Frauen unter 40 Jahren (Coulam et al. 1986)

Klinisch werden im allgemeinen wiederholte FSH-Spiegel über 40 IE/l für die Diagnose gefordert. Einzelbestimmungen des FSH sind zur Sicherung der Diagnose ungeeignet, da auch bei FSH-Werten über 40 IE/l sich Frauen mit spontaner Erholung der Ovarfunktion finden lassen. Es werden aber auch Formen dem POF-Syndrom zugerechnet, bei denen bereits die primäre Follikel nicht ausreichend angelegt waren (primäre Amenorrhoe). Diese primäre Ovarialinsuffizienz sollte in der Anamnese vom POF-Syndrom getrennt beschrieben werden.

Die Ursachen für ein POF-Syndrom sind vielfältig. Neben genetischen Faktoren spielen iatrogene Formen durch Ovarchirurgie, Chemotherapie oder Strahlentherapie und Assoziationen mit einer Vielzahl autoimmuner Erkrankungen, Infektionserkrankungen oder Umweltnoxen eine wichtige Rolle. 70-80% der Patientinnen mit einer Galaktosämie zeigen ein POF-Syndrom, das meist kurz nach der Pubertät einsetzt. Ursache ist oft die Störung der Galactose 1-Phosphat Uridyltransferase (GALT) mit den klinischen Zeichen einer verzögerten Wachstumsentwicklung, verringertem IQ und neurologischen Auffälligkeiten.

Mehr als 150 Mutationen im GALT-Gen sind bei Galaktosämie dokumentiert. Ein POF-Syndrom entwickeln meist Patientinnen mit dem Genotyp Q188R/Q188R. Erhöhte Galaktosespiegel sind für die ovarielle Entwicklung in der Fetalzeit toxisch mit einem initialen Abbau der Oogonien. Die Anamnese des idiopathischen POF-Syndroms sollte also neben iatrogenen Maßnahmen und Autoimmunkrankheiten, die zu dem Zustandsbild bei der Patientin geführt haben könnten, auch angeben, ob eine Galaktosämie bei der Patientin vorliegt.

X-Chromosomale Aberrationen und Deletionen bei Patientinnen mit POF-Syndrom sind seit langem bekannt. Klassischerweise wird das Vorliegen einer gonosomalen Monosomie X0 als Ulrich-Turner-Syndrom  bezeichnet. Neben der reinen Monosomie sind auch Mosaike (45,X0/46,XX bezw. 45,X0/46,XY) beschrieben. Die klinischen Zeichen umfassen Kleinwuchs, Stigmata wie Pterygium colli sowie eine hypergonadotrope Amenorrhoe mit primärer Ovarialinsuffizienz, d.h. eine Follikulogenese kann praktisch nicht beobachtet werden. Auch die Primärfollikel sind in der Regel nicht mehr vorhanden. Dazu kommt klinisch noch die mangelnde Entwicklung sekundärer Geschlechtsmerkmale und neurokognitiver Störungen.

Bei der Subgruppe der Patientinnen mit 45,X0/46,XY Chromosomensätzen werden meist auch dysgenetische Gonaden diagnostiziert mit dem Risiko der Entwicklung eines Gonadoblastoms (s.o.: Gonadoblastom Risiko bei Frauen mit Dysgenetischen Gonaden). Die Gonaden dieser Patientinnen werden deshalb in der Regel vor der Pubertät entfernt.

POF-Syndrome finden sich in Verbindung mit einer großen Variation autoimmuner Erkrankungen auch beim 47,XXX Karyotyp. Holland (2001) berichtet von einer 17-jährigen Patientin mit Triple X Karyotyp, hypergonadotroper sekundärer Amenorrhoe und idiopathisch zytopenischer Purpura. Generell wird das Auftreten eines vorzeitigen Ovarialversagens bei Triple-X mit ca. 37% der Fälle angegeben (Ogata und Matsuo, 1995)

Eine seltene genetisch bedingte faziale Dysmorphie ist das Blepharophimosis-Ptosis-Epicanthus inversus-Syndrom (BPES) . BPES kommt in 2 Typen vor. Typ I findet sich nur bei Frauen und ist mit einem POF-Syndrom assoziiert, Typ II beinhaltet ausschließlich die Dysmorphie ohne endokrine Auffälligkeiten. Das BPES kommt entweder spontan oder autosomal dominant vor. Ursächlich sind Mutationen im Gen FOXL2 auf Chromosom 3q23. Die Familie der Gene, zu denen FOXL2 zählt, sind für eine Reihe von Entwicklungsprozessen verantwortlich. Eine umfassende Mutationsanalyse des FOXL2 Gens bei Patienten mit BPES Typ I und II als auch bei 30 POF-Patientinnen ohne BPES zeigte bei 67% der BPES-Patienten insgesamt 21 verschiedene Mutationen und eine Mikrodeletion (Baere et al. 2001).

Bei POF-Patientinnen ohne die klinischen Zeichen des BPES war dagegen keine einzige FOXL2-Mutation nachweisbar. Diese eindeutige Genotyp-Phänotyp-Korrelation erlaubt es, durch eine einfache Augenwinkel-Diagnostik (BPES ja oder nein ?), die Subgruppe von POF-Patientinnen mit FOXL2 Mutation phänotypisch zu unterscheiden. Liegt die typische Augenlidfalte, ist eine FOXL2-Mutationsanalyse empfehlenswert. Die Zahl der beschriebenen FOXL2-Mutationen steigt ständig (Harris et al. 2002) 

In Anbetracht der in der Regel geringen Mutationsrate im Humangenom (10-5-10-6 pro Nukleotid pro Meiose oder pro Mitose-Verdopplung der DNA) ist die Untergliederung des noch sehr heterogenen klinischen Bildes des POF-Syndroms in mögöichst homogene Subgruppen sehr wichtig. Dazu gehört bei der klinischen Anamnese die sonografische Differentialdiagnostik auf das Vorhandensein, oder die Abwesenheit von Sekundärfollikel und antraler Follikel, die Angabe von Autoimmunkrankheiten, oder einer iatrogenen Vorgeschichte (z.B. Chemotherapie), sowie eine Laparoskopie bei allen Patienten mit idiopathischem POF-Syndrom. Die histologische Auswertung des Ovargewebes kann über die Markierung des Expressionsmusters Keimbahn-spezifischer Gene darüber hinaus eine klare Antwort auf die klinisch wichtige Frage einer potentiellen Rest-Follikulogenese im Ovargewebe der Patientin sicher stellen.

Literatur

Fassnacht W. et al. (2006)
Permature Ovarian Failure (POF) syndrome: Towards the molecular clinical analysis of its genetic complexity.
Curr. Med. Chemistry, 13: 1397-1410.

Laml T. et al. (2002)
Genetic disorders in premature ovarian failure.
Hum. Reprod. Update. 8: 483-91.

Strowitzki T, Vogt PH (2003) Genetik des Premature-ovarian-failure-syndroms.
Gynäkol. Endokrinologie 1: 128-134.

Vogt PH (2003) Genetic Disorders of Infertility. In: Cooper DN (ed.); London; Nature Publishing Group.
Nature: Encyclopedia of the Human Genome, vol. 3: pp. 458-464.

Keimzell-Diagnostik

Die Entwicklung routinefähiger Reagenzien für die genetische FISH- und DNA- Diagnostik mit Keimzellen steht im Brennpunkt unseres derzeitigen Forschungsprojekts „Einzel-Zell-Diagnostik“. Eine Keimzell-Diagnostik, statt Leukozytendiagnostik, wird vor allem für folgende Patientengruppen empfohlen:

Mann
  • bei Männern mit hochgradiger Oligozoospermie oder OAT Syndrom (>100-5000.000 Spermien)
  • bei Männern mit Klinefeltersyndrom
Frau
  • bei Frauen im Alter zwischen 35 und 40 Jahren mit wiederholt „unfertilisierbaren“ Eizellen
  • mit wiederholt auftretenden „Spontan-Aborten“
  • mit Eizellen von schlechter Morphologie oder Arrest im diplotänen „Germinal Vesicle“ Stadium

Eine erhöhte Aneuploidie-Rate wird insbesondere für die Chromosomen 13, 14, 16, 18, 21, 22, X, Y beobachtet! Sie lassen sich entsprechend farbig mit chromosomen-spezifischen DNA proben im FISH-Experiment und mit Hilfe eines Fluoreszenzmikroskopes parallel darstellen und auswerten.

Bei bekannten chromosomalen Anomalien diagnostiziert in Leukozyten, wie z.B. bei Männern mit dem Klinefelter-Syndrom, kann eine entsprechende FISH-Diagnostik in den Keimzellen diese Chromosomenanomalie quantitativ auswerten. Die Fraktion der XY Spermien in den Keimzellen des Klinefelter-Patienten ist ein direktes Maß zur Bewertung des erhöhten Risiko, über ICSI wieder ein Kind mit Klinefelter Syndrom zu zeugen.

Bei Frauen ist die FISH-Diagnostik der Keimzellen in den obengenannten Fällen vor allem in der Altersgruppe zwischen 35 und 39 Jahren sinnvoll. Dabei wird der Chromosomen-Status der Eizelle indirekt über die FISH-Diagnostik des ersten und zweiten Polkörperchens (PK1 und PK2) während der In-Vitro-Fertilisierung durchgeführt. Nach methodischer Etablierung der PK-Diagnostik soll als erstes Ziel versucht werden, die spontane Abortrate für ICSI/IVF-Fälle mit wiederholtem Implantierungsversagen deutlich zu senken und die Schwangerschaftsraten dieser Patientengruppe unter dem strengen Regelwerk des deutschen Embryonenschutzgesetzes  zu optimieren.

Liegt in der Familie eine bekannte Chromosomenanomalie wie z.B. eine balancierte autosomale Translokation von Chromosom 21 und 13 vor und wünschen die Eltern aber nur die Geburt eines Kindes mit normalem Chromosomensatz, so kann in Deutschland vorgeburtlich nur die Prä-Natal-Diagnostik (PND) angeboten werden. Die für IVF/ICSI Paare mögliche alternative Blastozyten-Diagnostik, auch Prä-Implantationsdiagnostik (PID) genannt, ist in Deutschland aufgrund des Embyronenschutzgesetzes nicht erlaubt.