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AZF-Deletionen und männliche Infertilität

Sektion für Reproduktionsgenetiik

Allgemeine Informationen

Heute ist allgemein bekannt, dass etwa 50% aller infertilen Männer aufgrund von direkten Störungen ihrer Keimzell-Reifung (Spermatogenese) eine deutliche Reduktion ihrer, oder eine komplette Abwesenheit reifer Samenzellen in ihrem Ejakulat haben, genannt, Oligozoo- bzw. Azoospermie. Die kausalen Ursachen sind vielfältig. Zumindest bei einer Subgruppe (etwa 30%) dieser großen Patientenzahl ist die Ursache wohl genetisch bedingt, d.h. eines oder mehrere Gene, welche die Fertilität des Mannes beeinflussen, sind defekt.

Durch die Einführung moderner Fertilisierungstechniken mit Einzel-Spermien (ICSI) besteht heute die prinzipielle Möglichkeit, daß auch Männer mit nur noch wenigen Spermien ihren Kinderwunsch noch erfüllen können. Wenn die Ursache der geringen Spermienzahl allerdings eine Chromosomen-Anomalie wie z.B. beim Klinefelter-Syndrom (47,XXY) oder ein molekularer Gendefekt ist, ist auch eine Übertragung dieser genetischen Anomalie auf die Nachkommenschaft möglich. Dabei ist aber meist unbekannt, wie groß das Risiko dieser Vererbung überhaupt ist und wie der genetische Defekt bei den Nachkommen der ICSI-Patienten dann auch phänotypisch zum Ausdruck kommt. Die zu erwartende Pathologie kann sich auf eine Wiederholung der Störung der Fertilität beschränken (wie z.B bei einer AZF-Deletion in Yq11), oder aber auch die körperliche Entwicklung beinflussen kann (wie beeinflussen z.B. im Falle verschiedener Chromosomen-Anomalien oder eine CFTR Mutation).

Wir konnten feststellen, dass in 10-20% der Patienten mit nicht-obstruktiver Oligozoo- oder Azoospermie die Ursache der Infertilität mit dem Auftreten von drei verschiedenen Mikrodeletionen auf dem langen Arm des Y-Chromosoms assoziiert ist. Sie werden AZFa, AZFb und AZFc genannt. Auch mikroskopisch sichtbare Deletionen des Y-Chromosoms (d.h. Makrodeletionen) werden bei infertilen Männern wiederholt beschrieben.

Alle 3 Y-Mikrodeletionen können dann die Deletion von mehreren Genen, die in den Bereichen AZFa, AZFb, bzw. AZFc lokalisiert sind (d.h. AZF-Gene) betreffen. Die Entschlüsselung ihrer molekularen Funktion für die männliche Spermienbildung steht weltweit im Fokus vieler Forschungsprojekte; so auch in unserem Labor.

Die kritische Abwägung, ab wann eine Yq11-Mikrodeletion einen kausalen Bezug zum sterilen Phänotyp des Patienten tatsächlich erlaubt, wird dadurch einerseits leichter (jedes Y-Gen innerhalb einer AZF-Region ist vermutlich ein wichtiges Spermatogenese-Gen), andererseits aber auch komplexer, da die funktionellen Aktivitätsphasen dieser AZF-Gene bisher noch wenig bekannt sind. Die Y-Gene in AZFa sind bereits während der Embryogenese und vor der Pubertät für die Bereitstellung und Differenzierung der Spermatogonien wichtig, die Y-Gene in AZFb und AZFc unterstützen die Reifung dieser Spermatogonien bis hin zu den motilen, befruchtungsfähigen Spermien.

In der einschlägigen Fachliteratur wurde nun wiederholt belegt, dass Männer mit einer kompletten AZFa- Deletion tatsächlich keine Keimzellen mehr in Ihrem Hodenepithelihren Hodentubuli aufweisen. Die klinische Diagnose heißt dann auch: „Sertoli-Cell-Only- (SCO)-Syndrom“.

Männer mit einer kompletten AZFb- Deletion haben nur vor der Meiose eine normale Spermatogenese; sie endet also mit einem „Meiotischen Arrest (MA)“.

Bei einer kompletten AZFc-Deletion können durchaus noch reife und befruchtungsfähige Spermien im Hodenepithel erwartet werden, wenn auch nur in geringer Zahl („Hypospermatogenese“).

Liegen dagegen nur partielle AZFa, AZFb, AZFc Deletionen vor, scheint die Hodenpathologie sehr variabel zu sein und u.U. auch altersabhängig.

Es ist deshalb für den Patienten mit diagnostizierter AZF-Deletion wichtig zu wissen, ob die Ursache der Fertilitätsstörung eventuell eine komplette AZFa oder komplette AZFb/c bzw. nur partielle AZF-Deletion darstellt. Nur bei partiellen AZFa/b/c und komplettem AZFc Deletionen kann eine erfolgreiche Anwendung des TESE- Verfahrens (d.h. eine Gewinnung von reifen Spermien im Hoden-Epithel) erwartet werden. Es ist heute auch möglich zu prüfen, ob im Hodenepithel nicht doch noch wenige Keimzellen, die sog. Stammzellen, anzutreffen sind, die eventuell in Zukunft als Ausgangszellen für eine Wiederbelebung der Spermatogenese nutzbar wären. Diese Linie der Stammzellforschung und Ihre klinische Anwendbarkeit steckt allerdings noch in den Kinderschuhen. Es kann deshalb heute noch keine Prognose abgegeben werden, ob sich auf diesem Wege dann auch tatsächlich eine neue Chance für die Bildung reifer Spermien aus den noch vorhandenen Stammzellen ergeben

Methodisch wird dazu das PCR-Multiplex Verfahren von Vogt & Bender (2013) empfohlen.

Heute verfolgt die AZF-Gen-Diagnostik vor allem das Ziel, die An- oder Abwesenheit der verschiedenen Keimzell-Typen im Hodengewebe des Patienten bereits vor der histologischen Gewebeentnahme mit einiger Sicherheit aus dem AZF-Gendeletionsprofil zu prognostizieren. Vorausgesetzt wird, dass der Chromosomenstatus im Rahmen der klinischen Voruntersuchung bereits diagnostiziert wurde und als normaler männlicher Karyotyp, 46,XY, bekannt ist.

Die AZF-Gendeletionen-Diagnostik wird mit der genomischen DNA extrahiert aus einer 10-20 ml EDTA Blutprobe durchgeführt. Bei Anwesenheit aller Gene in den AZF-Regionen wird mit einer aus der gleichen Blutprobe gewonnenen RNA-Probe eine Analyse des Expressionsmusters verschiedener AZF-Gene durchgeführt. Dabei liegt der Fokus der Diagnostik auf der Beantwortung der zentralen Frage, ob das Keimzellepithels des Patienten überhaupt noch in der Lage ist, Keimzellen zu bilden. Die Ursache für ein eventuell verändertes Expressionsprofil der AZF-Keimbahngene in den Leukozyten des Patienten wird dann über die Sequenzanalyse der DNA-Struktur des betreffenden Gens molekular mit Hilfe der DHPLC-Heteroduplex-Methode (WAVE® System von Transgenomics) entschlüsselt (Gen-Mutationsanalyse).

Wurde im Rahmen der klinischen Anamnese bereits eine histologische Diagnostik des Keimbahngewebes durchgeführt, kann eine entsprechende AZF-Genexpressionsdiagnostik auch mit der DNA aus dem durch die Biopsie gewonnenen Restgewebe die Ergebnisse der Biopsie durchgeführt werden. Neben einer DNA Extraktion aus diesem Hodengewebe kann dann auch eine RNA-Expressionsanalyse aus Leukozyten sinnvoll ergänzen. Auch kann eine immunohistochemische Diagnostik zur Analyse einer möglicherweise veränderten Lage der zugehörigen AZF-Proteine im Keimbahngewebe und die Expressionsdiagnostik noch vorhandenen AZF Gene Aufschluss darüber geben, ob diese in den noch vorhandenen Keimzellen des Patienten normal aktiv sind oder nicht. Für die Analyse von potentiell aktiven pluripotenten Stammzellen im Keimbahngewebe ist die AZF-Gendiagnostik im Hodengewebe eine notwendige Voraussetzung. In der noch vorhandenen Spermatogonien-Population im Keimbahngewebe des Patienten wird eine OCT3/4 Expressionsdiagnostik neben der Expressionsanalyse des AZFa Gens DDX3Y durchgeführt. Dadurch lässt sich klären, ob der Patient u.U. ein Kandidat sein kann für zukünftige Therapie-Möglichkeiten mit Keimbahn-Stammzellen [CERA Münster].
 

Ablauf der Untersuchung 

Zunächst wird werden in einer gründlichen klinischen Untersuchung in der Urologie, Andrologie oder in der Kinderwunschambulanz das Bild mögliche Ursachen für die Fertilisierungsstörung detailliert fest gehalten. Liegt eine Azoospermie, oder hochgradige Oligozoospermie vor, werden im Rahmen der dann folgenden AZF-Gendeletionsdiagnostik maximal 20 ml Voll-Blut (im EDTA-Röhrchen), sowie, falls vorhanden, der Rest des Keimbahngewebes für die DNA Extraktion aufgearbeitet, sofern es für die histologische Aufarbeitung und Befunderhebung nicht benötigt wurde. Die Einsendung dieser BlutprobePatientenproben schliesst ebenfalls die Beilage des zur angefragten Diagnostik zugehörigen Anamnese-Fragebogens-AZF mit ein, natürlich ausgefüllt mit allen klinischen Daten und eventuell Kopien bereits erhobener Befunde.
 

Nutzen/Risiken

Durch diese Untersuchung entstehen keine über das Standardabklärungsprogramm hinausgehende Risiken. Die Kosten der AZF-Gendeletionsdiagnostik trägt bei den oben beschriebenen Pathologien in der Regel die Krankenkasse. Selbstverständlich wird das aus den Blutzellen, oder dem Gewebe gewonnene genetische Material (DNA und RNA) nicht zur Durchführung sonstiger genetischer Analysen verwendet.

Ein direkter Nutzen für den Patienten, der ein Fortschritt in der Möglichkeit derden seiner weiteren klinischen Behandlung sein könnte, wäre, dass bei Vorliegen einer AZF-Gendeletion konkret das Vererbungsrisiko dieser Deletion auf die Nachkommenschaft selbst eingeschätzt werden kann, bzw. dass bei Vorliegen einer Azoospermie, der Erfolg des klinischen TESE Protokolls, durchgeführt in der Urologie und im IVF Labor, besser abgeschätzt werden kann. Gewebeentnahmen ohne die erfolgreiche Gewinnung von reifen Spermatozoen können eventuell sogar somit vermieden werden.

Folglich wird in Zukunft die genaue Kenntnis der strukturellen und funktionellen Komplexität der verschiedenen AZF-Gene im Hoden-Epithel eine wesentliche Voraussetzung für ihre klinische Diagnostik wie auch für die Entwicklung einer entsprechenden kausalen Therapie in der Zukunft sein.

Auf jeden Fall erscheint es heute auch aus klinischer Sicht sinnvoll, bei infertilen Patienten ohne klinische Erklärung (d.h. idiopathisch), die Diagnostik potentieller AZF-Gene und ihrer funktionellen Produkte (RNA und Proteine) noch vor der Anwendung von ICSI durchzuführen.

Bei der Anwendung des ICSI-Verfahrens in dieser Patientengruppe beträgt das Vererbungsrisiko für alle diagnostizierten AZF-Gen-Defekte für männliche Nachkommen 100%. Alle Söhne haben das gleiche Y-Chromosom, die Töchter sind aber nicht betroffen. Die Patienten werden entsprechend schriftlich und mündlich über Wesen und Tragweite der geplanten Untersuchung, insbesondere über den möglichen Nutzen für ihre Gesundheit und eventuelle Risiken aufgeklärt. Die Namen der Patienten und alle anderen vertraulichen Informationen unterliegen der ärztlichen Schweigepflicht und den Bestimmungen des Bundesdatenschutzgesetzes 

Informationen für Ärzte

In der Sektion wird auf der männlichen Seite bei:

  • Patienten mit nicht-obstruktiver Azoospermie und SCO Syndrom oder
  • Idiopathischer Oligozoospermie (5-10 Millionen Spermien pro Ejakulat), oder mit
  • OAT-Syndrom

die molekulare Diagnostik der AZFa, b, c Bruchpunkte in Yq11 und der 16 Gene in den AZFa, b, c Regionen angeboten. Durch die generelle Verwendung von PCR-Multiplex-Systemen wird dabei ein kostengünstiges molekulargenetisches Diagnostik-System mit Europäischem Qualitätsstandard angeboten, was dennoch eine komplexe Gen-Deletions-Diagnostik erlaubt. Positive und negative Kontrollexperimente im Parallelansatz sorgen für eine transparente und damit rasche Analyse potentieller Fehlerdaten. Mit diesem System dienen wir auch dem europäisch koordinierten Qualitätsmanagement  für die Analyse von Yq11-Mikrodeletionen als Referenzlabor.

Erste Richtlinien für eine einfache AZF-Deletionsdiagnostik mit 6 PCR-Duplex-Ansätzen wurden bereits 1999 publiziert. Die für die Klinik wichtigste Diagnostik kompletter AZF-Deletionen muß dabei aber in der Regel durch minimal 2, maximal 6 weitere PCR-Duplex oder Simplex-Ansätze erweitert werden. Die aktuellsten Richtilinien hierzu stammen aus dem Jahr 2013. 

Da nun die humane Y-DNA Sequenz komplett bekannt ist, kann diese 2-stufige genomische AZF-Deletionsdiagnostik durch eine gezielte AZF-Bruchpunkt und AZF-Gendiagnostik wesentlich verbessert werden.

Für die Klinik ist insbesondere die Differentialdiagnostik kompletter und partieller AZFa und AZFb Deletionen wichtig (Vogt, 2005).

Nur komplette Deletionen lassen eine Prognose auf die zu erwartende testikuläre Pathologie im Hodenepithel des Patienten zu.

Komplette AZFa Deletionen führen in der Regel zu einer kompletten Keimzell-Aplasie, auch Sertoli-Cell-Only-Syndrom genannt, komplette AZFb Deletionen zu einem meiotischen Arrest. Postmeiotische Keimzellen werden in beiden Fällen nicht im Hodenepithel dieser Patienten gefunden. Partielle AZFa und AZFb Deletionen mit variablen histologischen Bildern in Hodenschnitt-Präparaten der betroffenen Patienten weisen darauf hin, daß diese Deletionen u.U. kausal nicht für die Infertiliät des Patienten verantwortlich sind.

Komplette AZFc Deletionen führen in der Regel zu einer Reduktion der Spermienzahl des Patienten unter 5 Millionen (Krausz et al. 2003). Aber nicht alle Männer mit AZFc Deletion sind infertil. In der Literatur wird mehrfach die Transmission einer kompletten AZFc Deletion vom Vater auf die Söhne beschrieben. Die positive Diagnostik von partiellen oder kompletten AZFc-Deletionen gibt in der Klinik in der Regel eine gute Prognose für das Auffinden von reifen Spermien im Hodengewebe nach TESE (Choi et al. 2004).

AZFc-Deletionen, die kausal zu einer hochgradigen Oligozoospermie, oder sogar Azoospermie beim Mann führen werden zu 100% auf die männliche Nachkommenschaft übertragen, d.h. die Söhne dieser Väter können von Geburt an steril sein. Dass diese AZF-Deletionen dann auch zu einem vollständigen Verlust des Y Chromosoms und damit zu X0 Zellen in der frühen Embryogenese führen können, lässt sich zur Zeit nicht ausschließen (Vogt, 2004). Die entstehenden Mosaik-Karyotypen: 45,X0/46,XY werden in der Fachliteratur kausal für das Erscheinen von dysgenetischen Gonaden, für das Turner Syndrom, und für weitere somatische Pathologien verantwortlich gemacht (Chang et al.1990). Vor der Anwendung klinischer Befruchtungsverfahren sollten deshalb Männer mit AZFc-Deletionen bei Kinderwunsch auf diese generelle strukturelle Instabilität des Y-Chromosoms hingewiesen werden.

Für die Mutationsrate wurde aus dem eigenen Patientenkollektiv mit jetzt mehr als 1000 Patienten das Verhältnis 1:10.000 berechnet. Sechszehn Y Gene mit Protein-Expression im Hodengewebe wurden in diese 3 AZF-Loci kartiert (Tabelle AZF-Y-Gene). Sie haben entweder eine Kopie auf dem X Chromosom (in AZFa und AZFb), oder sind in mehreren Kopien auf dem Y Chromosom vorhanden (AZFb und AZFc).

Nachdem die Sequenz des humanen Y Chromosoms jetzt vollständig publiziert ist, wurden nicht nur die molekularen Ursachen für die genetische Komplexität der verschiedenen AZF Loci verständlich, sondern auch die Ursachen für die Instabilität und Heterogenität insbesondere des AZFc Locus. Intrachromosomale Rekombinationen zwischen langen repetitiven Sequenzblöcken, sogenannten Amplicons, in palindromischen Strukturen tragen zur heutigen Stabilität des humanen Y Chromosoms bei. Allerdings stellen sie andererseits aber auch die molekulare Ursache für die häufig auftretenden Deletionen und Umstrukturierungen im distalen Bereich von Yq11 dar.

Das humane Y Chromosom ist also strukturell sehr dynamisch und hat sich während der Evolution und Wanderung der verschiedenen menschlichen Populationen in Eurasien und Amerika wiederholt verändert. Diese Veränderungen konnten nun mit Hilfe einer grossen Zahl sogenannter binärer Y-DNA-Polymorphismen (RFLP und SNPs) in 153 Y-Haplogruppen unterteilt und einem einzigen Stammbaum zugeordnet werden (Y-phylogeny1). Die jetzt publizierte humane Y Sequenz ist danach der Y-Haplogruppe R zu zu ordnen, ein Y Chromosom welches insbesondere in Amerika und Europa mit verschiedenen untergeordneten Subtypen zu finden ist. Die weltweite Verteilung der 18 verschiedenen Y-Hauptgruppen (A bis R) spiegelt eindrucksvoll auch die verschiedenen Wanderungsrichtungen des Homo sapiens während seiner 5 Millionen Jahre Geschichte wieder (Y-Worldwide-pedigree). Die Anzahl der Y-Gene in den verschiedenen AZF Loci insbesondere in AZFb und AZFc ist somit bei Männern aus verschiedenen Populationen vermutlich oft variabel.

Im Rahmen der AZF-Forschungsprojekte im Labor werden insbesondere die Struktur und Funktion der AZFa-Gene: DBY, USP9Y und UTY und ihrer funktions-homologen Genkopien auf dem X Chromosom (DBX, USPX, UTX) studiert, sowie die Expression der BPY2, CDY1 und DAZ-Genfamilien in AZFc. Dabei steht die Untersuchung der Funktion dieser Gene in den verschiedenen Keimzellen im Vordergrund unseres Forschungsinteresses. Die damit verbundenen klinischen Syndrome (SCO bei AZFa-Deletionen; OAT bei AZFc-Deletionen) lassen den Schluss zu, dass AZFa Gene vor allem vor der Meiose, AZFc Gene vor allem nach der Meiose für die Human-Spermatogenese wichtig sind.

Diese Vorstellung konnte jetzt für das DBY Gen in AZFa experimentell bestätigt werden. Im Gegensatz zu seiner funktionshomologen X-Kopie, DBX, welches in allen Humangeweben als RNA wie Protein exprimiert wird, wurde die Expression des DBY Proteins nur in den Spermatogonien der männlichen Keimbahn nachgewiesen. DBX Protein wurde nur in Spermatiden entdeckt (DBY-prot-ISH). Dies erklärt, dass die Deletion von DBY bei Männern mit AZFa Deletion nicht durch die Expression von DBX kompensiert werden kann.