Leistungsspektrum

Durch chemische Muster an der Oberfläche der DNA, dazu zählt auch die sogenannte Methylierung, kann die Übertragung von Erbinformation in funktionelle Proteine reguliert werden. Diese Regulierung trägt dazu bei, dass sich die Zellen eines Organismus auf bestimmte Aufgaben spezialisieren können, obwohl alle Zellen eines Menschen die gleiche DNA-Information enthalten. Erbinformation, die in einer Leberzelle nicht gebraucht wird, kann so „abgeschaltet“ werden, während die gleichen Abschnitte in einer Lungenzelle aktiviert sein können und den Bauplan für Zellbestandteile liefern, die der Lungenfunktion dienen.

Zahlreiche Arbeiten haben gezeigt, dass sich auch Tumore in ihrer DNA-Methylierung unterscheiden. Diese Unterschiede lassen sich nutzen, um Tumore genauer zu diagnostizieren und in Subgruppen einzuordnen, als es mittels histologischer Untersuchung am Mikroskop möglich ist.

Die Methylierung der DNA einer zu untersuchenden Tumorprobe wird dazu mit einer Referenzbibliothek von Tumoren abgeglichen. Diese Referenzbibliothek und der zugehörige Algorithmus wurden in Heidelberg entwickelt.

Da bei diesem Verfahren hunderttausende Positionen auf der DNA ausgelesen werden, kann gleichzeitig auch eine Aussage darüber getroffen werden, ob bestimmte DNA-Abschnitte in ungewöhnlich hoher oder verminderter Anzahl vorhanden sind, also ob Copy-Number-Veränderungen auftreten. 

Dies ist insbesondere bedeutend für die Untersuchung einer 1p/19q-Ko-Deletion bei Verdacht auf ein Oligodendrogliom, auf Vorliegen einer EGFR-Amplifikation bei Glioblastomen oder Amplifikationen von MYC, MYCN, GLI oder Deletionen von TP53 oder PTCH1 bei Medulloblastomen. 

Teilweise lassen sich auch in dieser Analyse bereits Hinweise auf strukturelle Veränderungen der DNA finden, wie etwa KIAA1549::BRAF, c11orf95::RELA, NTRK1/2/3 oder FGFR1/2/3-Fusionen. Mutationen können von dieser Methode nicht erkannt werden. Auch der MGMT-Promoterstatus wird erfasst.

Die Dauer und Aussagekraft der Untersuchung hängt wesentlich von der Qualität (Erhaltungszustand, Tumorzellanteil) und der Menge ab. Ein geringer Tumorzellanteil oder geringe Probenmenge können die Interpretation erschweren oder verhindern, oder Wiederholungen der Analyse erforderlich machen.  

Informationen zur Beauftragung der Analysen finden Sie unter Einsenderinformationen

Durch Mutationen, d. h. Änderungen in der Abfolge der Bestandteile der DNA, können bestimmte Gene verstärkt aktiviert werden, die zu Tumorwachstum führen können (Onkogene), oder andere deaktiviert werden, die andernfalls das Tumorwachstum verhindern könnten (Tumorsuppressor-Gene). Das kann bereits durch den Austausch eines einzelnen DNA-Bausteins bedingt sein, was unterhalb der Detektionsschwelle der DNA-Methylierungs-Analyse liegt.

Diese „Punktmutationen“ und andere kleine Veränderungen können mittels einer Gen-Panel-Sequenzierung identifiziert werden. Dabei wird die Abfolge der DNA-Bausteine, der Basen, ausgelesen. Das „Heidelberg Brain Tumor Panel“ ist gezielt auf Gene ausgerichtet, deren Mutationen relevant für Hirntumoren sind. Die Auswahl der Zielgene ist so konfiguriert, dass alle diagnostisch relevanten und alle potenziell therapeutisch relevanten Gene untersucht werden. Diese breite Abdeckung wird möglich, da wir ein Hybrid-Capture-Verfahren einsetzen. Das Heidelberg Brain Tumor Panel durchbricht damit die technische Limitierung bisheriger Verfahren auf kleinere DNA-Abschnitte (Sanger-Sequenzierung, Amplicon-Panel-Sequencing), vermeidet aber gleichzeitig das Detektieren zahlreicher Veränderungen unklarer Relevanz, wie sie bei der Exom-Sequenzierung auftreten.

Für spezielle Fragestellungen führen wir auch die Sequenzierung des gesamten Exoms oder Genoms durch.

Das gleichzeitige Abfragen zahlreicher Gene erlaubt dabei eine effizientere und umfassendere Untersuchung als die Prüfung auf Mutationen mittels traditioneller Methoden wie Sanger-Sequenzierung. Zudem erlaubt die Technik des Next-Generation-Sequencing auch eine Quantifizierung der Mutation, sodass man noch genauere Aussagen darüber treffen kann, wie hoch der Anteil der mutierten Zellen ist.

Vorteile der Panel-Sequenzierung liegen in der Sensitivität und Effizienz: Bei diffus wachsenden Hirntumoren kann der Tumorzellanteil in der Probe gering sein. Die Panel-Sequenzierung kann noch geringste Mengen mutierter DNA im Material detektieren.

Der Nachweis einer bestimmten Mutation kann dabei ein entscheidender Parameter für die Diagnose (z. B. IDH1/2, H3F3A-Mutation) oder auch für die Therapie (z. B. Mutationen in BRAF, PTCH1, SMO, oder AKT1) sein. 

Die DNA-Methylierungs-Analyse und die Sequenzierung ergänzen sich: Während die Methylierungs-Analyse die Tumor-Art bestimmen und Copy-Number-Veränderungen nachweisen kann, erhält man aus der Sequenzierung die genauen Mutationen innerhalb der Gene. So kann zum Beispiel die DNA-Methylierungs-Analyse auf ein Medulloblastom der SHH-Gruppe hinweisen, jedoch können in dieser Gruppe verschiedene Mutationen mit unterschiedlichem Ansprechen auf Therapie auftreten (PTCH1, SMO, SUFU). Zwischen diesen lässt sich nur mittels Panel-Sequenzierung unterscheiden. Andererseits kann etwa der Nachweis einer BRAF-Mutation in der Panel-Sequenzierung in verschiedenen Tumoren auftreten (Gangliogliom, pilozytisches Astrozytom, pleomorphes Xanthoastrozytom). Für diese Unterscheidung ist wiederum ergänzend die Methylierungs-Analyse erforderlich.

Informationen zur Beauftragung der Analysen finden Sie unter Einsenderinformationen

Während sich mittels DNA-Sequenzierung vor allem Punktmutationen und kleine Veränderungen nachweisen lassen, entstehen viele Hirntumoren durch das Zusammenfügen zweier zuvor getrennter Genabschnitte – sogenannte Genfusionen. Dabei werden Teile zweier Gene so miteinander verbunden, dass ein neues, krankhaft aktives Genprodukt entsteht, das Tumorwachstum antreiben kann. Solche Fusionen lassen sich besonders zuverlässig auf Ebene der RNA nachweisen, also der Abschrift der DNA, die als Vorlage für die Bildung von Proteinen dient.

Bei der RNA-Sequenzierung wird die in der Zelle vorliegende RNA in eine stabile Form überführt und anschließend ausgelesen. Da bei der Bildung der RNA die nichtkodierenden Abschnitte eines Gens herausgeschnitten werden, lassen sich die Bruchpunkte zweier fusionierter Gene hier direkt und ohne die störenden Zwischenbereiche darstellen. Dies macht die RNA-Sequenzierung zur Methode der Wahl für den Nachweis von Genfusionen.

Der Nachweis bestimmter Fusionen kann sowohl für die Diagnose als auch für die Therapie entscheidend sein. Dazu zählen etwa KIAA1549::BRAF-Fusionen beim pilozytischen Astrozytom, c11orf95::RELA-Fusionen beim Ependymom oder Fusionen der NTRK1/2/3- bzw. FGFR1/2/3-Gene, für die zielgerichtete Therapien zur Verfügung stehen. Auch wenn sich in der DNA-Methylierungs-Analyse bereits Hinweise auf strukturelle Veränderungen ergeben können, erlaubt erst die RNA-Sequenzierung deren genaue Charakterisierung auf der Ebene des exakten Bruchpunkts.

Die DNA- und RNA-Sequenzierung ergänzen sich somit: Während die DNA-Sequenzierung Punktmutationen und kleine Veränderungen erfasst, schließt die RNA-Sequenzierung die diagnostische Lücke bei Genfusionen und strukturellen Umlagerungen. Wie bei den anderen Verfahren hängen Dauer und Aussagekraft der Untersuchung wesentlich von der Qualität und Menge des eingesandten Materials ab.

Informationen zur Beauftragung der Analysen finden Sie unter Einsenderinformationen

Für einzelne, klar umrissene Fragestellungen ist nicht immer eine umfassende Sequenzierung erforderlich. In diesen Fällen setzen wir die digitale PCR (dPCR) ein, ein Verfahren, mit dem sich einzelne genetische Veränderungen besonders schnell, empfindlich und präzise nachweisen lassen. Im Gegensatz zur herkömmlichen PCR wird die Probe dabei in viele tausend winzige Teilreaktionen aufgeteilt, die einzeln ausgewertet werden. Dadurch kann nicht nur festgestellt werden, ob eine bestimmte Veränderung vorliegt, sondern auch sehr genau bestimmt werden, in welchem Anteil sie im Material vorhanden ist.

Diese hohe Empfindlichkeit ist besonders dann von Vorteil, wenn nur wenig Material zur Verfügung steht oder der Tumorzellanteil in der Probe gering ist. Die dPCR kann selbst geringste Mengen einer Veränderung zuverlässig erfassen und eignet sich daher auch zur gezielten Bestätigung einzelner Befunde.

Ein wichtiger Anwendungsbereich ist die Bestimmung des MGMT-Promoter-Methylierungsstatus. Eine Methylierung des MGMT-Promoters führt dazu, dass das zugehörige Reparaturenzym vermindert gebildet wird. Tumoren mit methyliertem MGMT-Promoter sprechen daher in der Regel besser auf eine Behandlung mit alkylierenden Chemotherapeutika wie Temozolomid an, sodass dieser Parameter eine wichtige Rolle für die Therapieplanung bei Glioblastomen spielt. Mittels dPCR lässt sich der MGMT-Status quantitativ und mit hoher Genauigkeit bestimmen.

Darüber hinaus eignet sich die dPCR zum gezielten Nachweis einzelner diagnostisch oder therapeutisch relevanter Veränderungen sowie zur Bestätigung von Befunden aus anderen Verfahren. Sie ergänzt damit die DNA-Methylierungs-Analyse und die Sequenzierungsmethoden um ein schnelles und besonders sensitives Werkzeug für einzelne, gezielte Fragestellungen.

Informationen zur Beauftragung der Analysen finden Sie unter Einsenderinformationen

Ergänzend zu den etablierten Verfahren erproben wir den Einsatz der Nanopore-Sequenzierung für eine intraoperative molekulare Schnelldiagnostik. Wir weisen ausdrücklich darauf hin, dass es sich hierbei um ein experimentelles Verfahren handelt, das sich derzeit in der Entwicklung und Validierung befindet und nicht Teil der diagnostischen Routine ist.

Bei der Nanopore-Sequenzierung wird der DNA-Strang durch eine winzige Pore geführt; die dabei entstehenden charakteristischen Signaländerungen werden direkt in die Abfolge der DNA-Bausteine übersetzt. Im Gegensatz zu den übrigen Sequenzierverfahren liefert diese Technik Ergebnisse sehr rasch und erlaubt es zudem, chemische Muster der DNA wie die Methylierung unmittelbar mitzuerfassen.

Diese Eigenschaften eröffnen die Möglichkeit, bereits während einer laufenden Operation diagnostisch relevante Informationen zu gewinnen. Innerhalb kurzer Zeit lassen sich so ein methylierungsbasierter Klassifikationshinweis sowie ausgewählte Copy-Number-Veränderungen und der MGMT-Promoter-Status ermitteln. Solche Informationen können dem operierenden Team noch während des Eingriffs Anhaltspunkte zur Art des Tumors liefern und damit das chirurgische Vorgehen unterstützen. Das hierfür eingesetzte Auswertekonzept (Rapid-CNS) wurde in Heidelberg entwickelt.

Da sich das Verfahren noch in der Erprobung befindet, ersetzen die intraoperativ gewonnenen Ergebnisse keinesfalls die abschließende, umfassende Diagnostik. Sie werden stets durch die etablierten Methoden – DNA-Methylierungs-Analyse, Sequenzierung und histologische Untersuchung – bestätigt und in den endgültigen Befund integriert.

Informationen zur Beauftragung der Analysen finden Sie unter Einsenderinformationen

Tumoren des zentralen Nervensystems geben geringe Mengen ihrer DNA in die umgebenden Körperflüssigkeiten ab. Im Falle von Hirntumoren und insbesondere bei Tumoren mit Bezug zu den inneren und äußeren Liquorräumen lässt sich diese sogenannte zellfreie Tumor-DNA im Liquor cerebrospinalis (Nervenwasser) nachweisen. Die Untersuchung dieser frei zirkulierenden DNA wird als Liquid Biopsy bezeichnet und ermöglicht eine molekulare Diagnostik, ohne dass dafür Tumorgewebe operativ entnommen werden muss.

Dieser Ansatz ist besonders dann von Bedeutung, wenn eine Gewebeentnahme nicht oder nur eingeschränkt möglich ist, etwa bei tief gelegenen oder diffus wachsenden Tumoren, oder wenn der Krankheitsverlauf engmaschig beobachtet werden soll. Da der Liquor wiederholt und vergleichsweise schonend gewonnen werden kann, eröffnet die Liquid Biopsy zudem die Möglichkeit, das Ansprechen auf eine Therapie oder ein erneutes Tumorwachstum im Verlauf zu verfolgen.

Da die Menge an zellfreier Tumor-DNA im Liquor sehr gering sein kann, kommen besonders empfindliche Verfahren wie die Sequenzierung und die digitale PCR zum Einsatz, mit denen sich selbst kleinste Mengen tumorspezifischer Veränderungen nachweisen lassen. Die Aussagekraft hängt dabei wesentlich davon ab, in welchem Umfang der Tumor DNA in den Liquor abgibt, sodass ein unauffälliges Ergebnis das Vorliegen eines Tumors nicht sicher ausschließt.

Die Aufarbeitung der Liquorproben erfolgt in enger Zusammenarbeit mit dem Liquorlabor der Neurologie, das über die erforderliche Expertise in der Liquordiagnostik und der präanalytischen Verarbeitung dieser empfindlichen Proben verfügt. Diese Kooperation stellt sicher, dass das Material unter optimalen Bedingungen gewonnen und für die nachfolgende molekulare Analyse aufbereitet wird.

Informationen zur Beauftragung der Analysen finden Sie unter Einsenderinformationen

Die mikroskopische Untersuchung des Gewebes bildet weiterhin die Grundlage der neuropathologischen Diagnostik. Aus dem eingesandten Material werden hauchdünne Schnitte angefertigt und mit verschiedenen Färbungen behandelt, die unterschiedliche Gewebebestandteile sichtbar machen. Die klassische Hämatoxylin-Eosin-Färbung erlaubt einen ersten Überblick über den Gewebeaufbau, die Zelldichte und etwaige Auffälligkeiten, während spezielle Färbungen gezielt einzelne Strukturen wie Bindegewebe, Markscheiden oder Ablagerungen darstellen.

Ergänzt wird die konventionelle Histologie durch die Immunhistochemie. Hierbei werden Antikörper eingesetzt, die spezifisch an bestimmte Eiweiße im Gewebe binden und so deren Vorhandensein und Verteilung sichtbar machen. Auf diese Weise lassen sich Zelltypen genauer bestimmen, der Ursprung eines Tumors eingrenzen und mittlerweile auch zahlreiche molekulare Veränderungen direkt am Gewebeschnitt nachweisen, etwa mutationsspezifische Antikörper, die das veränderte Genprodukt erkennen. Die Immunhistochemie verbindet damit die räumliche Information des Gewebeschnitts mit Aussagen auf Proteinebene und liefert wichtige Anhaltspunkte für die Einordnung der nachfolgenden molekularen Untersuchungen.

Für die Diagnostik von Erkrankungen der Muskulatur und der peripheren Nerven kommen darüber hinaus spezielle Aufarbeitungs- und Färbeverfahren zum Einsatz. Muskel- und Nervengewebe werden hierfür in der Regel unfixiert und tiefgefroren verarbeitet, da viele der erforderlichen Untersuchungen am frischen Gewebe erfolgen müssen. An Nervengewebe ermöglicht die Zupfpräparation (Teasing) die Beurteilung einzelner Nervenfasern und ihrer Markscheiden und erlaubt so Aussagen über die Art einer Nervenschädigung. An der Muskulatur kommen neben den histologischen Färbungen insbesondere enzymhistochemische Verfahren zum Einsatz, bei denen die Aktivität bestimmter Stoffwechselenzyme direkt im Gewebeschnitt dargestellt wird. Diese Färbungen geben Aufschluss über den Fasertyp, die Verteilung der Fasern sowie über Veränderungen des Energiestoffwechsels, wie sie bei entzündlichen, neurogenen oder stoffwechselbedingten Muskelerkrankungen auftreten.

Informationen zur Beauftragung der Analysen finden Sie unter Einsenderinformationen