Tagesgleicher Nachweis der Clostridium difficile-Toxine A und B in Stuhlproben

Zweck der Untersuchung

Pathogene Stämme von Clostridium difficile produzieren die Toxine A und B, Toxin A ist ein Enterotoxin, Toxin B ein Zytotoxin. Bei V.a. eine Clostridium difficile-Infektion wird als Standardmethode ein ELISA gegen beide Toxine eingesetzt. Der Nachweis von Clostridium difficile Toxin A und/oder B im Stuhl erhärtet die klinische Verdachtsdiagnose einer Antibiotika assoziierten Enterokolitis. Die Verlaufsbeurteilung und Therapieüberwachung nach gestellter Diagnose erfolgen anhand klinischer Parameter. Bei Rezidiven ist jedoch ein erneuter Toxinnachweis sinnvoll.

Prinzip der Untersuchungsmethode

Der von uns verwendete automatisierte Test kombiniert eine 2-stufige immunenzymatische Methode, die auf dem Sandwichprinzip basiert, mit einer abschließenden Fluoreszenzmessung (ELFA). Der Festphasenrezeptor (SPR) dient gleichzeitig als Festphase und Pipettiersystem. Die Testreagenzien befinden sich gebrauchsfertig in dem versiegelten Reagenzienriegel. Die 4 Reaktionsschritte werden automatisch vom Gerät durchgeführt. Das Reaktionsmedium wird dabei mehrfach vom SPR aspiriert und wieder abgegeben. Auf jeden Reaktionsschritt folgt ein Waschschritt mit dem nicht gebundene Bestandteile entfernt werden.
Reaktionsschritt 1: Spezifische Bindung der in der Probe vorhandenen Toxine A und/oder B an die polyklonalen Anti-Toxin A Kaninchen-Antikörper und die monoklonalen Anti-Toxin B Maus-Antikörper, die am Festphasenrezeptor gebunden sind.
Reaktionsschritt 2: Bildung eines Komplexes aus Toxin A und Biotin-markierten Anti-Toxin A Antikörpern (monoklonal, Maus) und Bildung eines Komplexes aus Toxin B und Biotin-markierten Anti-Toxin B Antikörpern (monoklonal, Maus).
Reaktionsschritt 3: Die Anwesenheit von Biotin wird durch Inkubation mit Streptavidin nachgewiesen, welches mit Alkalischer Phosphatase konjugiert ist.
Reaktionsschritt 4: Alkalische Phosphatase katalysiert die Hydrolyse des Substrates (4- Methyl-umbelliferyl-Phosphat) in ein fluoreszierendes Produkt, dessen Fluoreszenz bei 450 nm gemessen wird. Der Wert des Fluoreszenzsignals korreliert mit der in der Probe vorhandenen Menge an Toxin A und/oder Toxin B.