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Leistungsspektrum

Die Neuropathologie Heidelberg bietet neben den molekulargenetischen Standardmethoden (Sanger-Sequenzierung, Pyro-Sequenzierung) folgende Hochdurchsatz-Methoden an:

DNA Methylierungs-Analyse

Durch Veränderungen an der Oberfläche der DNA, dazu zählt auch die sogenannte Methylierung, kann die Übertragung von Erbinformation in funktionelle Proteine reguliert werden. Diese Regulierung trägt dazu bei, dass sich die Zellen eines Organismus auf bestimmte Aufgaben spezialisieren können, obwohl alle Zellen eines Menschen die gleiche DNA Information enthalten. Erbinformation, die in einer Leberzelle nicht gebraucht wird, kann so „abgeschaltet“ werden, während die gleichen Abschnitte in einer Lungenzelle aktiviert sein können und den Bauplan für Zellbestandteile liefern, die der Lungenfunktion dienen.

Zahlreiche Arbeiten haben gezeigt, dass sich auch Tumore in ihrer DNA Methylierung unterscheiden. Diese Unterschiede lassen sich nutzen, um Tumore genauer zu diagnostizieren und in Subgruppen einzuordnen, als es mittels histologischer Untersuchung am Mikroskop möglich ist.

Die Methylierung der DNA einer zu untersuchenden Tumorprobe wird dazu mit einer Referenzbibliothek von Tumoren abgeglichen. Den Algorithmus hinter diesem Abgleich bildet der „Heidelberg Brain Tumor Classifier“ (www.molecularneuropathology.org). Dadurch lässt sich feststellen, welcher Tumorentität eine Probe zuzuordnen ist.

Da bei diesem Verfahren hunderttausende von Positionen auf der DNA ausgelesen werden, kann gleichzeitig auch eine Aussage darüber getroffen werden, ob bestimmte DNA Abschnitte in ungewöhnlich hoher oder verminderter Anzahl vorhanden sind, also ob Kopie-Zahlveränderungen auftreten. Dies ist insbesondere bedeutend für die Untersuchung einer 1p/19q Ko-Deletion bei Verdacht auf eine Oligodendrogliom, auf Vorliegen einer EGFR Amplifikation bei Glioblastomen oder Amplifikationen von MYC, MYCN, GLI oder Deletionen von TP53 oder PTCH1 bei Medulloblastomen. Teilweise lassen sich auch in dieser Analyse bereits Hinweise auf strukturelle Veränderungen der DNA finden, wie etwa KIAA1549:BRAF, c11orf95:RELA, NTRK1/2/3 oder FGFR1/2/3-Fusionen. Mutationen können von dieser Methode nicht erkannt werden. Auch der MGMT-Promoter Status wird erfasst.

Die Dauer und Aussagekraft der Untersuchung hängt wesentlich von der Qualität (Erhaltungszustand, Tumorzellanteil) und der Menge ab. Ein geringer Tumorzell-Anteil oder geringe Probenmenge können die Interpretation erschweren oder verhindern, oder Wiederholungen der Analyse erforderlich machen.  

DNA Panel Sequenzierung

Durch Mutationen, d.h. Änderungen in der Abfolge der Bestandteile der DNA, können bestimmte Gene verstärkt aktiviert werden, die zu Tumorwachstum führen können (Onkogene), oder andere deaktiviert werden, die andernfalls das Tumorwachstum verhindern könnten (Tumorsuppressor-Gene). Das kann bereits durch den Austausch eines einzelnen DNA-Bausteins bedingt sein, was unterhalb der Detektionsschwelle der DNA Methylierungs-Analyse liegt.

Diese „Punkt-Mutationen“ und andere kleine Veränderungen können mittels einer Gen-Panel-Sequenzierung identifiziert werden. Dabei wird die Abfolge der DNA Bausteine, der Basen, von aktuell 130 Genen (Tabelle) ausgelesen. Dieses „Heidelberg Brain Tumor Panel“ ist gezielt auf Gene ausgerichtet, deren Mutationen relevant für Hirntumoren sind. Die Auswahl der Zielgene ist so konfiguriert, dass alle diagnostisch relevanten und alle potentiell therapeutisch relevanten Gene untersucht werden. Diese breite Abdeckung wird möglich, da wir ein hybrid capture Verfahren einsetzen. Das Heidelberg Brain Tumor Panel durchbricht damit die technische Limitierung bisheriger Verfahren auf kleinere DNA Abschnitte (Sanger-Sequenzierung, Amplicon-Panel-Sequencing), vermeidet aber gleichzeitig das Detektieren zahlreicher Veränderungen unklarer Relevanz, wie sie bei der Exom-Sequenzierung auftreten.

Das gleichzeitige Abfragen zahlreicher Gene erlaubt dabei eine effizientere und umfassendere Untersuchung als die Prüfung auf Mutationen mittels traditioneller Methoden wie Sanger-Sequenzierung. Zudem erlaubt die der Panel-Sequenzierung zugrunde liegende Technik des Next-Generation-Sequencing auch eine Quantifizierung der Mutation, so dass man noch genauere Aussagen darüber treffen kann, wie hoch der Anteil der mutierten Zellen ist.

Ein weiterer Vorteil der Panel-Sequenzierung liegt in der Sensitivität: Bei diffus wachsenden Hirntumoren, kann der Tumorzell-Anteil in der Probe gering sein. Die Panel-Sequenzierung kann noch geringste Mengen mutierter DNA im Material detektieren.

Der Nachweis einer bestimmten Mutation kann dabei ein entscheidender Parameter für die Diagnose (z.B. IDH1/2, H3F3A Mutation) oder auch für die Therapie (z.B. BRAF, PTCH1, SMO, AKT1 Mutation) sein. 

Die DNA Methylierungs-Analyse und Panel-Sequenzierung ergänzen sich: Während die Methylierungs-Analyse die Tumor-Art bestimmen und Kopie-Zahlveränderungen nachweisen kann, erhält man aus der Sequenzierung die genauen Mutationen innerhalb der Gene. So kann zum Beispiel die DNA Methylierungs-Analyse auf ein Medulloblastom der SHH Gruppe hinweisen, jedoch können in dieser Gruppe verschiedene Mutationen mit unterschiedlichem Ansprechen auf Therapie auftreten (PTCH1, SMO, SUFU). Zwischen diesen lässt sich nur mittels Panel-Sequenzierung unterscheiden. Andererseits kann etwa der Nachweis einer BRAF Mutation in der Panel-Sequenzierung in verschiedenen Tumoren auftreten (Gangliogliom, pilozytisches Astrozytom, pleomorphes Xanthoastrozytom). Für diese Unterscheidung ist wiederum ergänzend die Methylierungs-Analyse erforderlich.

Voraussetzungen zur Untersuchung:

  • Einsendung von Tumor-Material
    • vorzugsweise FFPE Block und ein aktueller HE gefärbter Schnitt
    • alternativ 15 Leerschnitte und ein aktueller HE gefärbter Schnitt
    • im Ausnahmefall nach Rücksprache: gefrorenes Gewebe, bereits extrahierte DNA (>250 ng).

beiliegend ausgefüllter Einsendeschein und Kopie des aktuellen Neuropathologie-Befundes 

Technische Informationen und Limitationen

DNA Methylierungs-Analyse: 

Die DNA wird auf einem Illumina 850k EPIC BeadChip hybridisiert und auf einem iScan ausgelesen. Die Daten werden dann mittels des Heidelberg Brain Tumor Classifiers ausgewertet und im Kontext der sonstigen vorliegenden Informationen (Histologie, Vorbefunde) interpretiert. Die Aussagekraft hängt wesentlich von der Qualität des Eingangsmaterials ab. In Proben mit geringem Tumorzell-Anteil kann zum Teil keine eindeutige Zuordnung erfolgen oder Aussagen über das Vorliegen von Kopie-Zahlveränderungen nur mit Einschränkungen getroffen werden. Zur integrierten Bewertung des Ergebnisses ist daher erforderlich, dass uns auch ein Schnittpräparat und Informationen zu ggf. auswärts erhobenen Befunden vorliegen.

Dauer: Gesamtdauer abhängig von Fragestellung und begleitenden Analysen, Dauer der Rohdaten-Erhebung ab extrahierter DNA 5 Tage. Aufgrund des Chip-Designs erfolgt die Analyse einmal wöchentlich in 8er Gruppen.

 

Panel-Sequenzierung: 

Nach Extraktion wird die DNA mechanisch vorbehandelt („gesheard“). Die „Library“ (zu sequenzierende Genabschnitte mehrerer Proben eines Durchgangs) wird mittels eines eigens für die Neuropathologie Heidelberg entsprechend unserer Vorgaben erstellten Agilent SureSelect XT Kits erstellt. Die Sequenzierung erfolgt auf einem Illumina NextSeq 500 Sequencer mit einer Ziel-Coverage von 1.500x pro Probe. Durch technisch bedingte Varianz kann es trotz hoher Durchschnitts-Coverage zu unterrepräsentierten Abschnitten kommen, was falsch negative Befunde bedingen kann. Die detektierten Varianten werden mit bekannten Polymorphismen (u.a. 1000g-Projekt) abgeglichen, sofern vorliegend auch mit korrespondierender Blut-DNA.