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Dietmar-Hopp-Stoffwechselzentrum

Congenital Disorders of Glycosylation (CDG)

Arbeitsgruppenleiter: Priv.-Doz. Dr. rer. nat. Christian Thiel

Die Glykosylierung von Proteinen und Lipiden (Anheftung von Zuckerstrukturen an ein Eiweiß- oder Fettmolekül) spielt bei einer Vielzahl von biologischen Prozessen eine wichtige Rolle. Angeborene Defekte, die die Synthese oder die Prozessierung von Zucker- (Glykan-) strukturen von Glykokonjugaten betreffen, führen beim Menschen zumeist zu schweren neurologischen Defekten, die als "Congenital Disorders of Glycosylation" (CDG = angeborene Defekte der Glykosylierung) bezeichnet werden. Diese auf ein Protein übertragenen Zuckerketten gewährleisten u.a. die Funktionalität der Proteine beispielsweise als Enzyme, greifen weiterhin auch in eine Vielzahl lebenswichtiger Prozesse wie Wachstum, Differenzierung, Entwicklung von Organen, Signalübertragung, Abwehr, Entzündung sowie maligne Entartung ein.

Bei CDG-Patienten ist jeweils einer der zahlreichen Schritte, die in der Zelle die Zuckeranheftung steuern, defekt. Nachfolgend kommt es bei den Patienten oftmals zu einer Vielzahl von Symptomen wie bspw. Gedeih- und Entwicklungsverzögerungen, Durchfälle, Leber-, Herz- und Nierenprobleme, Blutgerinnungsstörungen, Krampfanfälle, verringertes Kleinhirnvolumen, Muskelschwäche, Fettpolster an Oberarmen und Gesäß, invertierte Brustwarzen, allgemeine geistige Retardierung, verzögerte Sprachentwicklung, Müdigkeit und Schwäche.

Obwohl seit der molekularen Erstbeschreibung von Patienten mit einem Glykosylierungsdefekt im Jahr 1996 die genetischen Ursachen von einer Vielzahl weiterer CDG-Defekte aufgeklärt werden konnten, steht zu vermuten, dass die bislang weltweit bekannten ca. 1500 CDG-Patienten lediglich die Spitze eines Eisbergs darstellen.


Glykosylierung von Proteinen

Die Glykosylierung von Proteinen stellt eine der häufigsten Formen der Proteinmodifikation in Tieren, Pflanzen und Bakterien dar. Glykoproteine treten in subzellulären Organellen wie dem endoplasmatischen Retikulum, dem Golgi, den Lysosomen, den Peroxisomen aber auch im Cytoplasma auf. Sie sind sowohl in zellulären Membranen als auch in extrazellulären Flüssigkeiten und Matrices vertreten.

Glykoproteine greifen in eine Vielzahl lebenswichtiger Vorgänge wie Wachstum, Differenzierung, Entwicklung von Organen, Signalübertragung, Abwehr, Entzündung und maligne Entartung ein. Im Rahmen der Glykoproteinbiosynthese werden Kohlenhydratketten schrittweise durch eine Reihe von Glykosyltransferasereaktionen erzeugt und anschließend kovalent an Aminosäurereste eines Glykoproteins angeheftet.

An der Glykosylierung von Proteinen sind vermutlich mehr als 300 verschiedene Glykosyltransferasen, Glykosidasen und Transportproteine beteiligt. Die an ein Glykoprotein angehängten Kohlenhydratketten schützen das Protein vor Proteasen, sind für die Funktionalität, die korrekte Faltung, die Löslichkeit sowie den gerichteten Transport eines Proteins innerhalb einer Zelle als auch zu spezifischen Zielzellen mitverantwortlich. In interzellulären Prozessen sind die Kohlenhydratseitenketten beispielsweise bei der Fertilisation, der Embryogenese oder der Zelladhäsion von großer Bedeutung. Die Aufklärung einer ganzen Reihe von vererbten Glykosylierungsdefekten beim Menschen in den letzten Jahren verdeutlicht die wichtige Funktion des Oligosaccharidanteils der Glykoproteine.


Ablauf der N-Glykosylierung

Die Synthese von Glykoproteinen ist ein höchst komplexer Vorgang, der im Cytoplasma, an der cytosolischen Seite der Membran des Endoplasmatischen Reticulums (ER), im Lumen des ER und im Golgi-Apparat abläuft. Die N-Glykosylierung beginnt an der cytosolischen Seite der ER-Membran, wo schrittweise zwei N-Acetylglucosamin (GlcNAc)- und fünf Mannose-Reste (Man) auf das Lipid Dolicholphosphat übertragen werden, so dass das Intermediat Man5GlcNAc2-PP-Dolichol entsteht. Dieses Intermediat wird nun in das Lumen des ER geflippt. Hier erfolgt die Übertragung von vier weiteren Mannoseresten sowie drei Glucoseresten (Glc), so dass das vollständige Oligosaccharid `G3Man9GlcNAc2-PP-Dolichol´ entsteht. Die Oligosaccharyltransferase (OST) transferriert das Oligosaccharid anschließend „en bloc“ auf die Asparaginreste von wachsenden Polypeptiden. Noch während sich das Protein in seine richtige Konformation faltet, werden die Glucosereste sowie ein Mannoserest von zwei Glucosidasen und einer Mannosidase wieder abgespalten. Das Protein wird in den Golgi-Apparat transportiert, wo weitere Trimming und Elongationsschritte mit weiteren Zuckerresten (N-Acetylglucosamin, Galaktose, Fucose, Sialinsäure) stattfinden.

Die einzelnen CDG-Typen werden anhand des jeweils betroffenen Proteins zusammen mit dem Kürzel `-CDG´ voneinander unterschieden. Ein Defekt in der Phosphomannomutase 2 (PMM2) wird daher als `PMM2-CDG´ bezeichnet.


In der Abbildung sind eine Vielzahl der bisher identifizierten N-Glykosylierungsdefekte durch gelbe Blitze hervorgehoben. Der Name des jeweiligen Defekts ist ebenfalls angegeben.

Symbole
Glucose: grüner Kreis; Mannose: roter Kreis; N-Acetylgalactosamin: blaues Quadrat; Galactose: pinker Kreis; Sialinsäure: gelbes Dreieck; Fucose: hellblauer Kreis


Einleitende Untersuchung bei CDG-Verdacht

CDG-Verdachtspatienten werden im Allgemeinen auf eine Veränderung der Glykosylierung ihres Serum-Transferrins hin untersucht. Dieses Glykoprotein trägt zwei biantennäre sialylierte Oligosaccharide vom komplexen Typ, die aufgrund der terminalen Sialinsäurereste negativ geladen sind. Fehlen aufgrund eines Glykosylisierungsdefekts des Patienten eine oder beide Ketten, kommt es zu einer Ladungsverschiebung und folglich zu einer Veränderung des isoelektrischen Punktes des Proteins. Diese Verschiebung kann mit Hilfe der Isoelektrischen Fokussierung (IEF) nachgewiesen werden, die zum CDG-Standardsuchtest geworden ist (siehe Abbildung). Um diese Untersuchung durchführen zu können, benötigen wir lediglich eine kleine Menge an Serum (ca. 0,5ml).

Hinweis: Das vollständige Glykosylierungsmuster des Serum-Transferrins wird zum Teil erst in einem Alter von 3 Monaten ausgeprägt. Daher wird bei Patienten, die jünger als 3 Monate sind, ein alternatives Markerprotein der CDG-Diagnostik, das alpha-1-Antitrypsin, auf eine Glykosylierungsveränderung hin analysiert.


Weiterführende Laboruntersuchungen

Wird während der CDG-Diagnostik ein auffälliges Bandenmuster in der Isoelektrischen Fokussierung des Serum-Transferrins eines Patienten beobachtet, finden weiterführende Untersuchungen statt, um den Glykosylierungsdefekt zu identifizieren bzw. einzugrenzen.

Bei den `CDG-Typ I´-Fällen, die Defekte in den frühen Schritten der Glykoproteinbiosynthese umfassen, wird zunächst die enzymatische Aktivität der Phosphomannomutase 2 (PMM2) und der Phosphomannose Isomerase (MPI) aus Fibroblasten bzw. Leukozyten des Patienten gemessen. Findet sich hier eine verminderte Aktivität, erfolgt die Mutationsanalyse des entsprechenden Gens. Bei einer normalen Aktivität der beiden Enzyme werden die metabolisch-markierten Dolichol-verknüpften Oligosaccharide aus Patientenfibroblasten bzw. -lymphoblasten mittels Dünnschichtchromatographie und HPLC analysiert und das defekte Enzym identifiziert. Die Bestimmung der Enzymaktivität sowie die Mutationsanalyse des für das defekte Protein kodierenden Gens schließt sich an.

Bei CDG-Typ II-Fällen, die Defekte in den späten Schritten der Glykoproteinbiosynthese umfassen, wird zunächst die Bestimmung der Protein-verknüpften Oligosaccharide aus Patientenserum mittels HPLC und Massenspektrometrie (A) durchgeführt. Das Methodenspektrum für weitere Untersuchungen beinhaltet Messungen von Enzym- bzw. Transporteraktivitäten (B), Immuncytochemie (C), Lektinbindestudien (D) sowie molekularbiologische Analysen (E) in Patientenfibroblasten bzw. -lymphoblasten.


PMM2-CDG

PMM2-CDG (zuvor CDG-Ia) ist sowohl der am längsten bekannte als auch der am häufigsten vorkommende Typ unter den "Congenital Disorders of Glycosylation". Etwa 60% aller CDG-Patienten leiden unter dieser Erkrankung, die durch die verminderte Aktivität des Enzyms Phosphomannomutase 2 (PMM2) hervorgerufen wird. PMM2 setzt im Cytosol Mannose-6-Phosphat zu Mannose-1-Phosphat um, welches für die Synthese von GDP-Mannose, GDP-Fucose und Dolichol-Phosphat-Mannose benötigt wird (siehe Abbildung 3). Durch die verminderte Bereitstellung von GDP-Mannose und Dolichol-Phosphat-Mannose kommt es bei den Patienten zu einer Verkürzung der Dolichol-verknüpften Oligosaccharide, die ein schlechtes Substrat für die Oligosaccharyltransferase darstellen, was zum partiellen Verlust kompletter Zuckerketten auf reifen Glykoproteinen führt.

Die verminderte Enzymaktivität der PMM2 konnte auf Mutationen im PMM2-Gen zurückgeführt werden, das beim Menschen auf Chromosom 16p13 lokalisiert ist. Auffällig ist, dass bei allen bisher identifizierten Mutationen eine Restaktivität von PMM2 beobachtet wurde, was Anlass zu der Vermutung gibt, dass ein totaler Aktivitätsverlust der Phosphomannomutase unvereinbar mit dem Leben ist.

Klinisch präsentieren sich die PMM2-CDG-Patienten durch geistige und körperliche Behinderung, Muskelschwäche, Ataxie, Gedeih- und Entwicklungsstörungen, invertierte Brustwarzen und Fettansammlungen an Oberarm und Gesäß. Weiterhin kann es zu Störungen im Leberstoffwechsel, zu Blutgerinnungsproblemen und Herzfunktionsstörungen kommen. Die Sterblichkeitsrate liegt aufgrund dieser Probleme in den ersten Lebensjahren bei ca. 20 %. Mit fortschreitendem Alter findet eine Stabilisierung des Gesundheitszustandes statt.

 


Forschung

Neben der Identifizierung neuer, bisher unbekannter Defekte des CDG-Typs sind wir besonders an der Aufklärung pathophysiologischer Vorgänge bei CDG und den damit verbundenen Einblicken in die generelle Bedeutung der Proteinglykosylierung sowie an der Entwicklung therapeutischer Strategien für CDG interessiert. Unserer Arbeitsgruppe gelang es in den letzten Jahren die molekularen Ursachen für 10 verschiedene CDG-Typen zu identifizieren und Mausmodelle für PMM2-CDG und SLC35C1-CDG sowie ein Froschmodell für PMM2-CDG zu generieren. Die apparative Ausstattung unseres Labors ermöglicht es uns sowohl die eingehenden Patienten- als auch unsere Forschungsproben umfassend biochemisch, genetisch, zellbiologisch oder histochemisch im eigenen Haus zu analysieren.

Unsere Forschungsprojekte werden durch Sachbeihilfen mehrerer öffentlicher Drittmittelgeber aus Deutschland sowie der Europäischen Union gefördert.


Kontakt und Ansprechpartner

Arbeitsgruppenleiter:
Priv.-Doz. Dr. rer. nat. Christian Thiel

Zentrum für Kinder- und Jugendmedizin Heidelberg
Analysezentrum III
Kinderheilkunde I
AG Glykosylierungsdefekte
Im Neuenheimer Feld 669
69120 Heidelberg

Tel.: 06221 56-39994 (Mobil)
Tel.: 06221 56-4817 (S2-Labor)
Tel.: 06221 56-1713 (S1-Labor)

Fax: 06221 56-5565
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Priv.-Doz. Dr. rer. nat. Christian Thiel (Arbeitsgruppenleitung)
Virginia Geiger (MTLA)
Dorothea Messner-Schmitt (MTLA)
Dr. rer. nat. Nastassja Himmelreich (PostDoc)
Dipl.-Ing. Markus Jost (Biologiedoktorand)
Dipl.-Ing. Kai Christian Thiemann (Biologiedoktorand)
M.Sc. Bianca Dimitrov (Biologiedoktorandin)


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